异牛肝菌素对人肝癌细胞smmc-7721的增殖抑制和诱导凋亡的分子机制研究

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1、目录中文摘要⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯1英文摘要⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯6研究论文异牛肝菌素对人肝癌细胞SMMC．7721的增殖抑制和诱导凋亡的分子机制研究前言⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．12日lJ舌⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．12材料与方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．13结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．20附图⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．23附表⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯

2、⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．32讨论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．36结论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．38参考文献⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．38综述蘑菇的药用价值研究⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．42致谢⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．56个人简历⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯57中文摘要异牛肝菌素对人肝癌细胞SMMC．7721的增殖抑制和诱导凋亡的分子机制研究摘要目的：恶性肝脏肿瘤是导致死亡的主要

3、原因之一。据统计，在亚洲，肝癌的发病率是最高的，尤其是在中国和日本。在中国，每年10万人中就有50人罹患此病。目前，中国肝癌是第二位引起癌症死亡的病因。传统的手术切除，并辅助以放疗、化疗等手段依然是主要的治疗措施。目前，临床上用的化疗药物在杀死癌细胞的同时，也杀死了正常的细胞和淋巴细胞，给患者造成了很大痛苦，因此，寻找高效、低毒的药物是摆在我们每位医务工作者面前的艰巨任务。来自植物和大型真菌的天然代谢产物是这类药物的首选。异牛肝菌素(iso．suillin)是从褐环粘盖牛肝菌(Suillusluteus)子实体中分离纯化得到的一种化合物，相对分子量为4

4、40．29，化学名为3，6．二羟基．[(2E，6E，10E)．3,7，ll，15．六甲基十六碳．2，6，10，14．四烯】苯乙酯，属于聚异戊二烯酚类化合物，是粘盖牛肝菌素suillin的同分异构体。初步研究结果显示，iso．suillin具有较强的抗氧化和抗肿瘤活性。本论文主要研究了iso．suillin对人肝癌细胞SMMC．7721的增殖抑制和诱导凋亡的分子机制。方法：1．细胞培养SMMC．7721细胞以RPMll640培养基培养，内含10％胎牛血清、青霉素100U／mL、链霉素100肛g／mL，置饱和湿度、37℃、5％C02培养箱培养。2．MTT法

5、检测细胞体外增殖活性不同浓度的iso．suillin(O，1．5，3，6，12，24gM)分别作用于对数生长期的人SMMC．7721细胞24h、48h和72h，应用四甲基偶氮唑蓝(Methythiazolyltetrazolium，MTT)比色法测定细胞光密度值(Opticaldensity，OD)，计算生长抑制率和半数抑制浓度(IC50)，做出生长曲线柱形图，从而筛选iso．suillin对SMMC．7721细胞的作用浓度。然后取不同浓度的iso—suillin、顺铂、5．氟尿嘧啶分别作用于SMMC．7721细胞培养48h，检测三种药物对细胞增殖的影

6、响；最后取不同浓度的iso．suillin、顺铂作用于人淋巴细胞24h，检测其对正常人淋巴细胞的影响。中文摘要以1．0x104／mL细胞浓度接种于96孔培养板，置于37℃，5％C02培养箱中培养。定时检测细胞生长情况，每孔加入5mg／mLMTT20gl，继续孵育4h，离心吸去上清，然后每孔加入150山二甲基亚砜(Dimethyl．sulfoxide，DMSO)。用酶标仪NIJ490nln波长吸光值(彳值)，每组设8个复孔，根据公式计算细胞活性，细胞活性=[1一(对照纵．实验NA)／对照组A1×100％，取其平均值并绘制细胞活性柱形图。3．流式细胞术检测

7、细胞周期和凋亡率将处于对数生长期的SMMC．7721细胞制成单细胞悬液，PBS冲洗2遍后用70％酒精固定，分别用EB和AnnexinV．FITC／PI进行荧光染色15min后进行流式细胞分析。计算出Go／G1、S、GJM期及早期和晚期凋亡分布百分比。4．克隆形成实验SMMC．7721细胞加入不同浓度的iso—suillin处理48h，后将悬浮的细胞以每d：L200个细胞重新种在6d：L板上。培养2周后，用4％的多聚甲醛固定，结晶紫染色，以可见菌落(大于50个细胞)计数，然后用Nikon相机拍照记录。5．细胞形态学观察SMMC．7721细胞种于6孔板后用

8、不同浓度的iso—suillin处王!J[48h。细胞用DAPI(DAPI[Sigma，USA