progress of digital pcr for single dna quantification 基于数字pcr的单分子dna定量技术研究进展

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1、生物化学与生物物理进展ProgressinBiochemistryandBiophysics2012,39(10):1017~1023www.pibb.ac.cn基于数字PCR的单分子DNA定量技术研究进展*李亮1)**,***隋志伟1)**王晶1)臧超1)余笑波2)(1)中国计量科学研究院，北京100013；2)浙江省计量科学研究院，杭州310013)摘要数字PCR是一项针对单分子目标DNA的绝对定量技术．该技术是将含有DNA模板的反应溶液分配到大量独立的反应室中并且发生扩增反应，通过统计反应室

2、中的阳性信号来定量DNA的拷贝数．DNA样品在反应室中随机和独立分布是单分子成功扩增和准确定量DNA拷贝数的关键因素．本文综述了数字PCR的发展历史、数字PCR与实时荧光定量PCR的区别，以及数字PCR在临床诊断、转基因成分定量、单细胞基因表达、环境微生物检测和下一代测序等方面的最新进展，并展望了该技术的应用前景．关键词数字PCR，绝对定量，实时荧光定量PCR，拷贝数，单分子学科分类号Q7DOI:10.3724/SP.J.1206.2012.00003核酸的序列、多样性和丰度分析是现代生物学毛细管

3、进行了微升(滋l)级的PCR反应，通过荧光探的基础．核酸定量技术在诊断和个体化医疗、食品针收集到基因组DNA的单分子信号，进而发展了[8][3]检验和转基因生物检测、病原体鉴定、法医科学等单分子定量技术．1999年,Vogelstein和Kinzler方面已被广泛应用，同时这些应用也推动了核酸定基于以上报道采用96孔板系统发展了微升级的[1]量技术的进步．PCR扩增方法，用于结肠癌的致癌突变基因ras的DNA分子扩增技术的应用促进了分子生物学定量分析．随之，Dressman等发明了一种技术的发展[

4、2]．精确定量DNA拷贝数是现代分子BEAMing方法(珠子、乳剂、扩增与磁力)[9]：将链生物学和医学的重要应用之一．数字PCR(digital霉亲和素与磁珠共价结合，磁珠外包裹一层生物素polymerasechainreaction，dPCR)作为DNA定量的的PCR引物，进行扩增反应．反乳化作用后，使[3-4]用流式细胞仪通过磁珠分析等位基因变异．尽管步新技术，克服了实时荧光定量PCR(realtimequantitativePCR，qPCR[5])的一系列缺点，实现了骤较多，该技术仍不失为

5、广泛应用于实验室定量单分子DNA绝对定量．dPCR是将单个DNA样品DNA的理想方法，可以用来检测和定量单核苷酸反应液分别进行数以百计的反应，并且每个反应分多态性(singlenucleotidepolymorphism，SNP)或突[10]别进行扩增检测．dPCR是DNA绝对定量方法，变等核酸序列变异及含有变异等位基因的磁珠能解决了qPCR所用的标准曲线对测量结果产生影响够被流体分离排序，因而可应用于样品测序等序列等问题，并可减少qPCR带来的基体效应[6]．此技分析[11]．术在临床诊断、转基

6、因成分定量、单细胞基因表尽管dPCR技术具备广阔应用前景，但由于达、环境微生物检测和下一代测序等方面的研究发96孔或384孔平板加样的复杂操作为精确测量带挥了重要作用．来了困难，也难以解决高通量测量问题．微流体的1dPCR技术发展历史*国家科技支撑计划资助项目(2008BAK41B01).1992年，Sykes等[7]报道了基于样品稀释和泊**共同第一作者.***通讯联系人.松分布数据处理的巢式PCR定量技术，并提出了Tel:010-64276678,E-mail:liliang@nim.ac.c

7、n数字PCR的构想．1997年，Kalinina等使用玻璃收稿日期：2012-01-03，接受日期：2012-03-15·1018·生物化学与生物物理进展Prog.Biochem.Biophys.2012;39(10)出现和纳升(nl)反应仪器的开发克服了这些技术的程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析，瓶颈．在2003年，Liu等[12]使用微流体的概念，在以此来评估PCR的扩增效果[16-18]．qPCR主要依赖微流体芯片上进行了400个独立的3nlPCR反应．于校准物制备的标准曲线，进而

8、确定未知样品的浓2008年，嵌入式芯片的PCR反应次数达到了度，因此是一种相对定量的方法．该技术存在以下[13]9180个6nl的PCR平行反应．例如，Fluidigm问题：a．校准品和样品间背景的不同将引入偏差，公司的Biomark系统，此系统微流体dPCR芯片由并且影响PCR的效率和测量响应[6]；b．低拷贝数12个独立的微流体面板(panel)和相应进样孔组成的目标DNA分子不能通过扩增检测到[14]；c．样品(图1).每个面板含有765个6nl的独立反应室的PCR扩增效率可