产酶芽孢杆菌筛选、鉴定及对肉鸡微生态效应的研究

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1、论文独创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文足我个人在导师指导下进行研究工作所取得的成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，学位论文中不包含其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得l珏lJfl农业大学或其它教育机构的学位或证书所使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。～虢缸卉砷纠瑚加关于论文使用授权的声明本人完全了解l四Jll农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅，可以采用影

2、印、缔印或扫描等复制手段保行、汇编学位论文。同意V_qJlI农业大学可以用不同方式各不同媒体上发表、1々播学位论文的全部或部分内容。研究生签名：导师签名叩年／溯珈年／z，月秽日眦7眦∥眦4洲Ⅲm■1Im0㈣8⋯Ⅲ1㈣Y、～疋一湫俨四川农业大学博L学位论文摘要本文对实验室分离保存的芽孢杆菌进行产酶活性筛选，并对筛选得到的一株产酶活性高的芽孢杆菌进行16SrDNA序列分析鉴定，研究其对雄性小鼠的生殖系统安全性、采用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测在肉鸡肠道中消长规律、ERIC—PCR和PCR—DGGE检测肉鸡口服该菌悬液后肠道菌群多样

3、性，然后制成活菌制剂观察其对肉鸡生长性能、肌肉品质、肠道菌群、消化酶活性和免疫功能的影响。结采如下：1．采用平板培养法对10株芽孢杆菌产蛋白酶、纤维素酶、淀粉酶活性进行初选，然后采用比色法测定芽孢杆菌发酵培养液酶活性进行复选。筛选出产酶活性较高的芽孢杆菌Pab02菌株。根据细菌的16SrDNA序列两端的保守性设计通用引物，提取菌株的基因组DNA，对菌株的16SrDNA的进行PCR扩增，并列扩增得到的目标片段进行测序，将测序结果与NCBI上己知菌种的16SrDNA序列进行同源性比较和构建系统发育进化树进行分析，结合细菌形态特征、生理生化特性

4、，最终确定芽孢杆菌Pab02为枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)。2．为了评价该菌的安全性，选用72只昆明系雄性小鼠，随机分成6组。药物对照组，每只小鼠按20mg／kg体重经口灌喂环磷酰胺，1次／d，连续5d，诱导小鼠产生生殖毒性；药物对照组和空白对照组小鼠饲喂不舍任何益生菌和抗生素的日粮，芽孢杆菌I组、II组、III组和Ⅳ组分别饲喂含有10’，100，107CFU／g和108CFU／g的饲料。饲喂至30d时，每组随机剖杀6只，检测小鼠睾丸、附睾重，精子畸形、精子活力，睾丸组织中MDA含量和SOD活性，精子顶体酶活力，血清睾

5、酮(T)含量，并通过组织切片观察雄性小鼠睾丸的组织结构。结果湿示，芽孢杆菌Pab02对小鼠体重、小鼠睾丸和附睾重均有明显的增重效果；芽孢杆菌Pab02可提高小鼠精子活率，对精子畸形的减少没有明显的作用；芽孢杆菌Pab02可降低小鼠睾丸组织中MDA含量，提高睾丸组织中SOD活性、精子顶体酶活力和Jfn．清睾酮的含量，芽孢杆菌Pab02对小鼠的睾丸组织结构有一定的改善作用。结果表明，芽孢杆菌Pab02对雄性小鼠是安全的，没有造成生殖毒性，对雄性小鼠生殖功能有一定的促进作用。3．芽孢杆菌Pab02菌：悬液按2ml／kg体重(109CFU／m1)

6、灌喂28口龄的肉鸡，2次／d，连续3d后，收集肠道内容物，采用RT-qPCR检测肠道内容物中芽孢柑：菌的数量。结果，对照组(灌喂等量的PBS液)肉鸡肠道内芽孢杆菌数住5．37"一6．10log潘膝成(2009)产酶芽他t-t‘菌的筛选、鉴定及对肉鸡的微，：态效应研究Copies／g之间，当连续口服芽孢杆菌Pab02菌悬液后，十-3旨肠内的芽孢杆菌数量从12h到第4d显著高丁二对照组，第5d后恢复到对照组水平；空肠、回肠和直肠从12h到第5d显著高于对照组，第6d后恢复到对照组水平。盲肠内的芽孢杆菌数量在36h和60h时显著高于对照组。结果

7、表明，芽孢杆菌在对照组肉鸡肠道中的数量较少，芽孢杆菌Pab02作为微生态制剂铡喂动物，须长期投服或问断时间不超过3d。4．芽孢杆菌Pab02菌悬液连续灌喂28口龄肉仔鸡3d后(2次／d)，收集停喂3d的肠道内容物，采用ERIC，PCR／PCR．DGGE方法分析电泳指纹图谱条带数及相似性指数，以及对DGGE特异性条带回收、测序分析其肠道菌群。结果显示，两种方法都证明肉鸡口服芽孢杆菌Pab02后各肠段的条j蒂数及特征性条带均明显多于对照组，说明芽孢杆菌Pab02具有提高肉鸡肠道菌群多样性和种群密度；通过对电泳指纹图谱条带的聚类分析，两种检测方

8、法显示肉鸡肠道蔺群结构的多样性变化规律相似，两组肉鸡肠道细菌之间存在着种群的差异性，但两组之间肠道总菌群的相似性系数为53．2％，存在着较高的相似性，说明该年龄段的肉鸡肠道微生物种群存在着一定