产胶原蛋白酶枯草芽孢杆菌的筛选

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1、第29卷第4期大连工业大学学报VoI．29No．42010年7月JournalofDalianPolytechnicUniversityJu1．2010文章编号：1674—1404(2010)04—0248—03产胶原蛋白酶枯草芽孢杆菌的筛选孙佳佳，王红英，钱斯日古楞，常凯(大连工业大学生物与食品工程学院，辽宁大连ii6034)摘要：为了得到产胶原蛋白酶的微生物，以海产品市场附近采集的污泥为样品，经过富集培养后通过明胶培养基进行筛选，获得1株产胶原蛋白酶的菌株。通过形态观察和生理生化特征分析，以透明圈和菌落直径之比(HC)为检测指标，初

2、步鉴定该菌株为芽孢杆菌属。对它产生的胶原蛋白酶进行分离和活力测定，得到的酶活力为44．982U／mL。经SDS-PAGE凝胶电泳检测，该酶将分子质量为100ku左右的胶原蛋白水解成为8ku左右的短肽，说明该酶能有效水解胶原蛋白。关键词：芽孢杆菌；胶原蛋白酶；筛选中图分类号：Q93文献标志码：AScreeningofcollagenase。producingBacillusstrainSUNJia—jia，WANGHong-ying，QIANSi-ri—gu·leng，CHANGKai(SchoolofBiological&FoodEng

3、ineering，DalianPolytechnicUniversity，Dalian116034·China)Abstract：Microbesproducingcollagenasewereisolatedinglutinmediumfromenrichedcultivationofthemudoffishmarket．Basedonthehigherratioofhydrolyzelooptocolonydiameter(HC)，astrainwith44．982U／mLofcollagenaseactivitywasisolat

4、ed．ThestrainshouldbeBacillussubtilisbythewayofmorphologyandbiochemistrycharacteristics．Furtheranalysisshowedthatthecrudeenzymewithcollagenolyticactivitycouldhydrolyzed100kuofthenativecollageninto8kuofthesmallmoleculesubstance．Keywords：bacillus；collagenase；screenO引言蛋白酶的微生

5、物，并对其进行初步鉴定。胶原蛋白酶(Collagenase，E．C3．4．24．3)是1材料与方法作用于胶原或其变性明胶而不作用其他蛋白质的酶类。它来源广泛，多种微生物以及动物的许多1．1材料组织细胞都可以产生胶原蛋白酶l_I]。目前已发现样品，采自大连市海产品批发市场附近的污泥。溶组织梭菌、溶藻弧菌等微生物能产生胶原蛋白主要试剂：胶原蛋白粉末，本实验室自制；酪酶，并不断发现新的产胶原蛋白酶的微生物¨2]。蛋白，金铂铱科技有限公司。枯草芽孢杆菌生境多样，可利用的营养物质1．2产胶原蛋白酶菌的筛选种类十分丰富，这决定了其具有丰富的产酶系统

6、，l_2．1培养基具备生产多种酶的应用潜力]。研究表明，枯草富集培养基(100mL)：胶原蛋白10g，酵母芽孢杆菌能够产生蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶、葡膏0．01g。聚糖酶、植酸酶、果胶酶和木聚糖酶等十几种明胶培养基(100mL)：明胶2．0g，蛋白胨酶_4]。近年来，对枯草芽孢杆菌的研究已渐进到0．5g，KH2PO40．05g，MgSO4·7HzO0．02g，遗传学与微生物学领域_5]，但由枯草芽孢杆菌提NaC10．01g，pH7．2～7．5，琼脂1．5g。取出胶原蛋白酶的文章还未见报道。本实验以海1．2．2富集培养产品市场附近的污泥为

7、样品，筛选新的高产胶原取污泥10g置于三角瓶中，加100mL富集收稿日期：2009—10—19．基金项目：辽宁省教育厅A类项目(2008063)．作者简介：孙佳佳(1985一)，女，硕士研究生；通信作者：王红英(1968一)，女，副教授第4期孙佳佳等：产胶原蛋白酶枯草芽孢杆菌的筛选249培养基。在32℃摇床培养48h后过滤，取滤液。10min后，立即加入3．0mI的10三氯醋酸溶1．2．3初筛液，摇匀静置15min，过滤，收集的即是样品的滤将滤液稀释，分别在10～10～。下各取lmL液。另取一试管，先加入1．0mL酶液和3．0mL于明胶

8、培养基用稀释涂布法在平皿上将菌液涂的1O三氯醋酸溶液，再加入2．0mL0．5的酪匀，28℃条件下培养48h，选择生长良好、形态明蛋白溶液，混匀后于3O℃水浴保温10min，过滤，显并有透明圈菌落的平皿。收集