抗人l-pgds基因工程抗体构建及表达

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1、学位论文独创性声明本人郑重声明：l、坚持以“求实、创新”的科学精神从事研究工作。2、本论文是我个人在导师指导下进行的研究工作和取得的研究成果。3、本论文中除引文外，所有实验、数据和有关材料均是真实的。4、本论文中除引文和致谢的内容外，不包含其他人或其它机构已经发表或撰写过的研究成果。5、其他同志对本研究所做的贡献均已在论文中作了声明并表示了谢意。作者签名：举迅辇同期：；d．丘!!学位论文使用授权声明本人完全了解南京师范大学有关保留、使用学位论文的规定，学校有权保留学位论文并向国家主管部门或其指定机构送交论文的电子版和纸质版；有

2、权将学位论文用于非赢利目的的少量复制并允许论文进入学校图书馆被查阅：有权将学位论文的内容编入有关数据库进行检索：有权将学位论文的标题和摘要汇编出版。保密的学位论文在解密后适用本规定。硕士学位论文朱国毕抗人L—PGDS基囡T程抗体的构建及表达抗人L—PGDS基因工程抗体的构建及表达摘要Lipocalin型前列腺素D合成酶(Lipoca]in—typeProstagladinDSynthase，L-PGDS)亦称B—trace蛋白，是机体组织屏障的主要成分，属Lipocalin家族。L—PGDS主要分布于哺乳动物的中枢神经系统和雄

3、性生殖器官，并分泌至脑脊液、血清、精液、尿液、羊水等体液中。L-PGDS是一种双功能蛋白，除催化PGD。产生外，亦可结合和运输亲脂／疏水分子。该蛋白具有广泛的生理学作用，它不仅与睡眠诱导、体温调节、感受伤害、气味应答等有关，办是一种生育相关蛋白，可能参与精子的发生和成熟。研究表明，L-PGDS与许多疾病密切相关，如L-PGDS不同程度地表达于卵巢癌、乳腺癌等组织，病毒性脑膜炎、脑脊膜瘤、椎管狭窄、脑栓塞等病人的CSF中L-PGDS明显升高。为了建立L-PGDS的免疫学检测方法并探讨其在男性生殖系统中的具体功能、代谢过程、作用机

4、制以及与男性不育的关系等，本实验室以毕赤氏酵母表达了人睾丸L-PGDS抗原，成功制各了兔抗人L-PGDS多克隆抗体和鼠抗人L—PGDS单克隆抗体。兔源多抗实际上是多种抗体的混合物，具有不均一性，无论是对抗体分子结构与功能的研究还是临床应用都受到很大限制；而特异性鼠单抗具有异源性，应用于人体研究会引发人抗鼠抗体的毒性反应，并使抗体在体内消除加快等。因此，应用于I临床的理想抗体应是人源的，但人一人杂交瘤技术目前尚未突破，且还存在人一人杂交瘤体外传代不稳定、抗体亲合力低及产量不高等问题。目前解决此问题的较好办法之一是研制基因工程抗体

5、，代替鼠源单抗应用于临床。本研究试利用基因工程技术，构建和表达目前研究较多也较成熟的单链抗体、人一鼠嵌合抗体，为L-PGDS的功能性研究以及临床相关疾病的诊断、治疗奠定基础。本研究第一部分首先采用RT-PCR技术，以一组自前导序列的简并引物，从1株稳定分泌抗人L-PGDS单抗的鼠杂交瘤细胞中扩增出抗体的轻链可变区基因2个、重链可变区基因1个：然后分别克隆至pGEM-T载体，并测序。测序结果表明，其中1个VK为鼠骨髓瘤细胞系中固有的无功能基因：另一VK和VH经KabatIg比对分析，与其同源性较高的序列均为鼠免疫球蛋白可变区基因

6、，且碱基序列符合鼠抗体可变区特征。本研究第二部分利用一柔性连接短肽[(GIy)．Ser]。，SOEPCR法将上述重、第4页硕士学位论文朱国华抗人L—PGDS摹因丁程抗体的构建及表达轻链可变区拼接成完整的抗人L-PGDS单链抗体基因，并装入表达载体pET一28a(+)，在BL21宿主菌中进行表达。经SDS—PAGE检测显示，在低剂量O．02mMIPTG诱导和在较低温度25。C或28℃下培养，重组菌表达了一定量的可溶性单链抗体。后经Ni—NTA亲和层析柱纯化，得率为2mg／100ml，纯度达92％；双夹心ELISA和免疫荧光竞争抑

7、制实验证实，纯化后的抗人L-PGDS单链抗体具有较好的亲和力和特异性。本研究第三部分选用嵌合抗体轻、重链分别表达载体，利用限制性双酶切位点，将上述轻、重链可变区基因构建成人一鼠嵌合轻链表达质粒pAG4622／VL和人一鼠嵌合重链表达质粒pAH4604／VH。重组轻、重链表达质粒先后经DOTAP试剂转染入同一Sp2／O细胞，酶酚酸或组氨醇筛选后用ELISA和RT—PCR检测表达产物。结果仅获得稳定表达抗人L-PGDS人一鼠嵌台轻链蛋白的细胞株，且其细胞中存在相应的嵌合轻链mRNA：而未能继续筛选得到稳定表达嵌合重链的细胞株。总之

8、，嵌合轻链的稳定表达，为后续抗人L-PGDS人一鼠嵌合抗体的获得奠定了一定的基础。关键词：前列腺素D合成酶：男性生殖；单克隆抗体；可变区；基因克隆：基因工程抗体：单链抗体：原核表达系统；人一鼠嵌合抗体；真核表达系统；酶联免疫吸附试验第5页硕士学位论文朱国华抗人L-PGDS基因