抗TfR人鼠嵌合抗体杆状病毒共表达载体的构建、表达与鉴定

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1、英文缩略词表ADCCantibody-dependentcell-mediatedcytotoxicity抗体依赖的细胞介导的细胞毒效应AmpAmpicilinblood-青霉素BBBbrainbarrierBase血■脑屏障碱基Bppair对CDCcomplement-dependentcytotoxicity补体依赖的细胞毒实验cDNAComplementaryDeoxyribonucleicAcid互补脱氧核糖核酸DNADeoxyribonucleicAcid脱氧核糖核酸ELISAEnzymelinkedimmunosorbentas

2、say酶联免疫吸附试验FBSFetalBovineSerum胎牛血清FCMFlowCytometry流式细胞术人■抗鼠HAMAhumananti-mouseantibody抗体辣根过氧化物酶HRPhorseradishperoxidase免疫球蛋口GIgGImmunoglobulinGkDKilodalton千道尔顿KbKilobasepair千碱基对单克mAbMonoclonalantibody隆抗体多克隆位点平均荧光MCSMultipleclonesite强度MFIMeanfluorensenceintensityODOpticalde

3、nsity吸光度PBSPhosphatebufferedsolution磷酸盐缓冲液PCRPolymeraseChainReaction聚合酶链式反应PEPhycoerythrin藻红蛋口PMSFPheylmethylsulfbnylfluoride苯甲基磺酰氟化物PVDFPoly-VinylideneDifluoride聚偏二氟乙烯RT-PCRReverseTranscriptionPolymeraseChainReaction逆转录聚合酶链反应SDRsspecificity-determiningresidues特异性决定基TfTran

4、sferrinTfRtransferrinreceptorTMBtetramethylbenzidineSDS-PAGEsodiumdodecylsulfate-polyacrylamidegelelectrophoresis变性■聚丙烯酰胺凝胶电泳转铁蛋白转铁蛋口受体四甲基联苯胺抗TfR人/鼠嵌合抗体杆状病毒共表达载体的构建、表达与鉴定硕士研究牛：张婷指导教师：沈关心教授中文摘要【目的】构建抗人TfR人/鼠嵌合抗体昆虫杆状病毒共表达系统，为进一步利用昆虫杆状病毒表达系统表达基因工程抗体，以及开展以TfR为靶点的肿瘤免疫显像与治疗研究奠定基

5、础。【方法】通过PCR技术分别扩增抗TfR人/鼠嵌合抗体的轻链和重链V区；通过基因工程技术构建抗TfR人/鼠嵌合抗体蛋白二聚体的重组杆状病毒Bacmid共表达载体，并进行表达；采用M13F/M13R特异性引物经PCR扩增进行验证后，感染Sf9昆虫细胞，收获病毒滴度较高的重组杆粒再次感染Sf9昆虫细胞以获得浓度较高的目的蛋白；表达产物通过ELISA方法检测浓度并浓缩纯化；SDS-PAGE鉴定纯化产物；Westernblotting检测嵌合抗体与TfR蛋白的结合活性；FCM检测嵌合抗体与多株肿瘤细胞表面TfR特异性结合的能力。【结果】PCR扩增

6、出的抗TfR人/鼠嵌合抗体的轻链和重链V区基因片段经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定，其片段人小与理论值相符，经测序鉴定显示其DNA序列完全正确。重组杆状病毒经PCR扩增显示其产物片段大小与理论值相符。ELISA检测显示在感染后的Sf9细胞培养上清中有大量抗体表达。收集培养上清经浓缩纯化后，SDS-PAGE和Westernblotting鉴定显示表达产物具有嵌合抗体重链和轻链条带，k分子量大小正确。Westernblotting检测显示表达产物能够与TfR蛋白结合，但FCM检测表达产物嵌合抗体分子与细胞表面TflC的肿瘤细胞结合率较低，与空白对照比较

7、几乎无明显差异。【结论】成功构建了表达抗TfR人/鼠嵌合抗体的重组杆粒Bacmid™+[H/L]共表达载体，通过感染Sf9昆虫细胞后能够表达完整的嵌合抗体分子，Westernblotting检测显示表达产物能够与TfR蛋白结合，但FCM检测其表达产物与细胞表面TflC肿瘤细胞结合率与空白对照比较无明显差异，分析其原因可能由于表达量低，或者VL区极少数碱基突变所致，因此对该载体系统的表达量及其表达产物与细胞表面天然受体的结合活性的条件优化均有待进一步探索。关键词转铁蛋白受体；人/鼠嵌合抗体；昆虫杆状病毒表达系统；Sf9昆虫细胞Engineer

8、ingexpressionandidentificationofabaculovirusco-expressedmouse/humanchimericantibodyagains