水牛7sku6启动子克隆、活性分析及抗口蹄疫转基因小鼠模型建立

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1、博博士学位士论文张晓溪水牛7sk水牛7sk/U6启动子克隆、活性分析及/U6抗口蹄疫转基因小鼠模型建立启动子克隆、活性分析及抗口张晓溪蹄疫转基因小鼠模型建立2013二○一三年六月分类号S814.8密级公开UDC博士学位论文水牛7sk/U6启动子克隆、活性分析及抗口蹄疫转基因小鼠模型建立张晓溪学科专业动物遗传育种与繁殖指导教师石德顺研究员刘庆友研究员论文答辩日期2013年6月4日学位授予日期答辩委员会主席李力教授广西大学学位论文原创性和使用授权声明本人声明所呈交的论文，是本人在导师的指导下独立进行研究所取得的研究成果。除已特

2、别加以标注和致谢的地方外，论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写的研究成果，也不包含本人或他人为获得广西大学或其它单位的学位而使用过的材料。与我一同工作的同事对本论文的研究工作所做的贡献均已在论文中作了明确说明。本人在导师指导下所完成的学位论文及相关的职务作品，知识产权归属广西大学。本人授权广西大学拥有学位论文的部分使用权，即：学校有权保存并向国家有关部门或机构送交学位论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅，可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索和传播，可以采用影印、缩印或其它复制手段保存、汇编学位论

3、文。本学位论文属于：□保密，在年解密后适用授权。□不保密。(请在以上相应方框内打“√”)论文作者签名：日期：指导教师签名：日期作者联系电话：电子邮箱：水牛7SK/U6启动子克隆、活性分析及抗口蹄疫转基因小鼠模型建立摘要水牛具有适应性强、耐高温高湿、抗病力强、耐粗饲、容易饲养、使用年限长等优点，非常适合我国南方农村饲养，是我国南方极具开发价值的大家畜。口蹄疫是一种由口蹄疫病毒引起的以侵害偶蹄动物为主的急性、热性、高度接触性传染病，被世界动物卫生组织列为A类动物传染病。为应用水牛RNA聚合酶III启动子进行基因沉默研究，探讨应

4、用RNAi沉默水牛口蹄疫病毒的可行性，本研究对水牛的7SK和U6启动子进行了克隆与活性分析，并应用其构建了多启动子串联RNAi抗口蹄疫病毒转基因小鼠模型，取得了如下的研究结果：1、水牛7SK和U6启动子克隆与功能分析。参考牛的基因组序列，设计特异性扩增引物，成功克隆了长430bp和357bp的水牛7SK（Genbank序列号：JN417658）和U6启动子（Genbank序列号：JN417659）。为对比不同物种polIII启动子的活性，本研究还克隆了人、猪和牛的7SK和U6启动子。克隆的启动子与针对EGFP的短发卡RNA

5、（shRNA）双链DNA片段（shEGFP）相连接，成功构建8个EGFP沉默表达载体（pbu7SK-shEGFP、pbuU6-shEGFP、ph7SK-shEGFP、phU6-shEGFP、pbo7SK-shEGFP、pboU6-shEGFP、pp7SK-shEGFP和ppU6-shEGFP）。将构建的载体转染水牛胎儿成纤维细胞（BFF），转染后72小时通过茎-环QRT-PCR检测细胞RNA中的shEGFP相对表达量。结果显示，以h7SK-shEGFP组为100%，bu7SK-shEGFP和buU6-shEGFP组中的sh

6、EGFP含量高达257.17%I（±33.79%）和174.67%（±32.94%），表明水牛7SK和U6启动子能启动shEGFP在细胞中高效表达。将构建的载体与pEGFP-N1共转染水牛和小鼠细胞，转染后60h在荧光显微镜下可观察到共转shEGFP表达载体的细胞发生了明显的荧光表达沉默现象；转染后72h的BFF流式细胞仪分析发现，转入pbu7SK-shEGFP和pbuU6-shEGFP的细胞中沉默EGFP效果显著高于其它各组，沉默效率高达93.82%(±0.16%)和87.45%(±0.52%)(p<0.05)。QRT-

7、PCR的检测结果显示，pEGFP-N1与bu7SK-shEGFP共转染水牛细胞的EGFP表达水平（下降93.29%±1.30%）和buU6-shEGFP共转染的EGFP表达水平（下降93.45%±1.25%）差异不显著（p>0.05），两者的EGFP表达水平均显著低于其它物种启动子的共转染组（p<0.05）。在小鼠细胞中，共转染bu7SK-shEGFP的EGFP沉默效率最高（下降91.29±1.03%）。上述结果表明，克隆得到的水牛7SK、U6启动子可以高效启动shRNA的表达，进而产生沉默目的基因的RNA。2、多shRN

8、A串联抗口蹄疫病毒RNAi载体的构建。首先针对口蹄疫病毒3B和3D保守区域设计并化学合成三个shRNA串联片段，然后分别连接水牛7SK、水牛U6和牛U6启动子，构建成bu7SK-Cons1-buU6-Cons2-boU6-Cons3三个shRNA串联表达盒，并连接入慢病毒载体质粒pSicoR构建成抗口蹄