ghef1a8启动子克隆与功能分析及抗草甘膦转基因棉花研究

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1、密级:论文编号:中国农业科学院学位论文GhEF1A8启动子克隆与功能分析及抗草甘膦转基因棉花研究CloningandFunctionanalysisofGhEF1A8PromoterandDevelopmentofGlyphosate-tolerantTransgenicCotton博士研究生：孙豹指导教师：郭三堆研究员申请学位类别：理学博士专业：生物化学与分子生物学研究方向：植物分子生物学与基因工程培养单位：中国农业科学院生物技术研究所2014年5月万方数据Secrecy:No.ChineseAcademyofAgricultu

2、ralSciencesDissertationCloningandFunctionanalysisofGhEF1A8PromoterandDevelopmentofGlyphosate-tolerantTransgenicCottonPh.D.Candidate：SunBaoSupervisor：Prof.GuoSanDuiMajor：BiochemistryandMolecularBiologySpecialty:PlantmolecularBiologyandGeneEngineeringMay2014万方数据摘要棉花（Gos

3、sypiumspp.）属被子植物门、双子叶植物纲、锦葵目、锦葵科木槿亚科、棉属，是一种多用途的重要经济作物。早在9世纪便在中国发现棉花的种植，发展至今我国已成为世界最大产棉国之一，种植范围遍及国内25个省市自治区，创造了大量的经济收益和社会价值。近年来转基因棉花特别是转基因抗除草剂棉花与抗虫棉在世界范围内的大规模推广和应用，变革了传统的棉花耕种模式，大幅提高了棉花的产量和质量。目前我国转基因抗虫棉研究已经取得了较大的进展，但转基因抗除草剂棉花的研制却起步较晚，并未育成高效稳定的抗除草剂转基因棉花品种，为此本研究从植物基因工程角度出

4、发，通过克隆分离棉花地上组织高效表达启动子、优化改造草甘膦抗性基因、外源多基因组装策略等方面的研究，对抗草甘膦转基因棉花的研究进行了新的探索。首先以棉花组成型高表达蛋白质延伸因子（GhEF1A）基因家族为切入点，对其9个家族成员的组织表达特性进行分析，进而采用基因组染色体步移（TAIL-PCR）技术分离获得GhEF1A8基因上游启动子区域序列，在运用生物信息学手段对启动子结构及其调控区域中潜在的顺式作用元件进行分析预测的基础之上，构建了启动子全长、5’UTR缺失及一系列启动子5’端缺失片段的植物表达载体，通过转基因烟草GUS的组织

5、化学染色及荧光酶活测定，对启动子的组织表达特性及其活性调控的分子机理进行了分析。同时对抗草甘膦新型EPSP合酶gr79基因及N-乙酰转移酶gat基因进行了密码子改造和基因结构优化，结合GhEF1A8启动子与棉花叶绿体前导肽（GhCTP）等载体元件构建了一系列单双价植物表达载体，通过转基因烟草和转基因棉花的分子生物学分析及草甘膦抗性鉴定,初步验证了抗草甘膦基因的抗性，并获得了对草甘膦有较强抗性的双价抗草甘膦转基因棉花。基于上述研究，得到主要结果如下：1.对棉花GhEF1A基因家族表达特性分析发现其9个基因家族成员（GhEF1A1-G

6、hEF1A9）高度同源，但在棉花叶片中表达强度有显著差异，其中GhEF1A8基因表达量达到内参基因Ghubi表达量的8倍，远高于其他家族成员。此外GhEF1A8基因在棉花各组织部位都能表达，其中茎组织部位表达强度仅此于叶片基因表达量，表达量为内参基因Ghubi的5倍以上。2.首次分离获得GhEF1A8基因上游启动子区，TAIL-PCR分离得到的序列片段长1679-bp，其中包含了143-bpGhEF1A8基因编码序列。采用PlantCARE、PLACE及ScanWM-P等生物信息学工具对启动子结构及潜在的顺式调控元件进行预测分析，

7、发现GhEF1A8启动子不仅存在TATA-box、CAAT-box、GC富集区等高等植物启动子基本调控元件，同时还包含了多种的逆境应答元件及转录调控元件，如GT-1motif、W-box、LTR和A/T-rich等。除此之外克隆得到的序列片段中包含了一个长度为242-bp的5’UTR区域，该区域中存在一个非翻译的外显子、一个植物内含子结构及一个5’UTRPy-richstretch元件。3.基于生物信息学分析结果，构建了GhEF1A8启动子全长、5’UTR缺失及一系列启动子5’端缺失片段的植物表达载体并进行了转化烟草研究。GUS组

8、织化学染色及荧光酶活测定分析显示，GhEF1A8启动子主要在烟草植株的地上组织表达，在叶片及茎组织中表达强度分别为CaMV启动子的2倍和4倍。5’UTR能够在几乎所有组织器官中增强GhEF1A8启动子的表达，尤其是在烟草叶片和茎组织中GUS活性分别