抗草甘膦epsps基因克隆、载体构建及亚麻遗传转化

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1、抗草甘膦EPSPS基因克隆、载体构建及亚麻遗传转化第一章文献综述1抗除草剂转基因的研究概况植物的转基因技术是指将从动物、植物、细菌或病毒等生物中分离到目的基因和将目的基因构建入表达载体，并通过一定的方法将含有目的基因的表达载体转移到受体植物的基因组DNA中，使之稳定遗传表达并使其具有新的优良性状，如抗逆、抗病、抗虫、高产、优质等，从而实现遗传重组，创造新种质，育成新品种的现代生物技术[13]。转基因作物是指利用分子生物学技术将目的基因导入受体作物所获得的具有新性能的作物，是现代农业生物技术的产物。迄今为止，全世界范围种植生产的主要转基因作物有4种，即玉米、棉花、

2、大豆和油菜[14，15]。1983年首例转基因烟草由美国专家培育成功[16]，1994年，世界上第一种转基因植物转基因晚熟西红柿诞生，并在美国被批准大规模进入市场，开创了转基因作物商品化的先河[17，18]。到2013年为止，全世界先后有30个国家先后批准了3000多例大田转基因作物的试验[19]。植物转基因已成功在多达35科200多种植物当中获得成功[20，21]。转基因作物的发展方向主要有：植物修复生态系统、抗除草剂、抗虫、植物疫苗、抗病等几个方面。以导入的目的基因性状来说，抗除草剂的作物种植面积在全世界范围内为首位，2005年，因此，抗除草剂转基因作物在转

3、基因中占有非常显著的位置[22]。1994年抗烟草花叶病毒（TMV）和抗黄瓜花叶病毒（CMV）双价的转基因烟草在我国第一次合法种植[23]，1997年我国第一次批准了转基因后熟西红柿的商品化生产和销售[16]。在植物基因转化核心技术创新方面[14，15]。2抗除草剂转基因作物的研究现状和前景杂草对农业生产是一重大威胁。杂草不但与作物争夺养分、水分和光照，对作物的品质也有非常严重的影响，而且杂草也是病害和虫害的天然培育场所，所以严重时，甚至会对作物的产量产生十分严重的影响，对农作物带来了非常严重的危害[5]。目前，应用化学除草剂是防杂草的主要方法。由于化学除草具有

4、省时、省工、高效等优点，使其成为农田除草技术中最经济、最可靠和最为普遍的的除草方法。在现代农业生产和实践中利用化学除草剂控制杂草成为其重要的组成部分[7]。但化学除草剂的使用情况有多方面的限制，如作物对除草剂的敏感性、杂草的性质、化学除草剂的种类和不同化学除草剂对不同作物的作用不同和施用除草剂的花销等。而这些对杂草有效防止的除草剂同时也能使作物受到伤害，这就严重限制了这些除草剂在生产实践中的使用。因此选育抗除草剂作物品种成为当前急需攻克的难关。在最近几十余年来，随着对除草剂对植物的作用机制和植物对除草剂反应机理的深入研究以及基因分离转化技术的快速发展，植物抗除草

5、剂转基因技术已经获得了很大的进展，已从各种菌类及突变的植物等生物体分离出抗除草剂基因(表1.1)。第二章材料与方法1试验材料与试剂1.1材料1.1.1植物材料抗草甘膦转基因油菜由美国Monsanto公司培育；非转基因油菜陇油7号由甘肃省农业科学院作物所油菜课题组馈赠；陇亚10号种子由甘肃农业科学院作物所提供。1.1.2菌种与质粒Gateerase购自NEB（北京）有限公司；Marker购自上海英骏公司；质粒提取试剂盒、pENTRTM/D-TOPOòCloningKits、Gateemix和JETQUICKGelExtractionSpinKit均购

6、自上海英骏生物技术有限公司。植物激素类：萘乙酸(NAA)、6-苄氨基嘌呤(6-BA)均为国产；抗生素类：头孢霉素(cefotaximeSodium)、卡那霉素(Kanamycin)、利福平(Rifampicin)、潮霉素（Hygromycin）和PPT为Sigma分装产品，购自TIANGEN公司（北京）；其余相关药品和试剂、除草剂草甘膦都为国产试剂。.1.3PCR引物根据抗草甘膦（EPSPS）基因序列（美国Monsanto公司获得的专利：US5633435），用软件PrimerPremier5.0设计引物。分别在两对上游引物5端加入了CACC四个碱基，根据不同表

7、达载体的需要，分别设计了下游5'端含有终止密码子的引物pEarlygate100和不含终止密码子的引物pMDC139。引物由上海英骏生物技术有限公司完成。..第三章结果与分析.......251利用Gateg/L头孢霉素（cef），转基因愈伤组织和不定芽诱导过程中最适的选择压为20mg/L的潮霉素、10mg/L的PPT和60mg/L的草甘膦。通过NAA、活性炭和多效唑优化亚麻再生苗生根培养基，得出最佳生根培养基是1/2MS+0.01mg/LNAA+0.5%活性炭+0.01mg/L多效唑。