亚麻fad3基因克隆及载体构建与遗传转化

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1、亚麻FAD3基因克隆及载体构建与遗传转化第一章绪论1.1植物脂肪酸的研究植物脂肪酸主要以两种形态存在，一种是用于构成生物膜的甘油脂和磷脂，另一种是以甘油三脂（TAG）的形式贮藏在种子中的贮藏态脂。贮藏态脂是一种封闭的相对惰性的光合产物，其主要成分的改变不影响植物总的分解功能，因此植物脂肪酸的生物合成途径特别适合遗传操作[6]。植物脂肪酸的生物合成反应步骤如图1.1所示。在植物的种子中，脂肪酸的合成是在质体中进行，在这个过程中由脂肪酸合成酶所催化。在种子的发育过程中，蔗糖作为合成脂肪酸的主要碳源，从光合作用的器

2、官（如叶片）转运到种子细胞中，通过糖酵解途径将其转变成丙酮酸，并氧化成乙酰辅酶A，即脂肪酸合成的前体物。由乙酰辅酶A经过一系列的反应生成不同链长（C8-C18）的脂肪酸，并与酰基载体蛋白ACP结合成脂肪酸合成酶复合体，同时酰基碳链增长，并在酰基ACP硫酯酶作用下，游离的脂肪酸从酰基载体蛋白ACP复合物中释放出来，并且在羧基CoA合成酶的作用下合成酰基CoA后穿过质体进入内质网或胞质中，在多种酶作用下进一步代谢和修饰，包括脂肪酸的脱饱和及链的延长等[7]。脂肪酸是细胞膜脂的主要成分，也是重要的基本能源，又是一些

3、信号分子的前体，与其他物质一起分布于机体表面，防止热量的散发与机械损伤等。此外它与细胞识别、物种特异性和组织免疫等有密切的关系[8]。例如，植物体内的脂肪酸与植物的抗寒性有密切的关系，当植物体能的不饱和脂肪酸减少时，植物的抗寒性就会减弱。同时，植物脂肪酸具有很大的食用价值。人体可以自主合成单不饱和脂肪酸，但不能合成亚麻酸等维持人体正常机能的必需脂肪酸，从而只能通过食物获得。1.2不饱和脂肪酸的研究除饱和脂肪酸以外的脂肪酸就是不饱和脂肪酸，它是构成人体内脂肪的一种必需的脂肪酸。不饱和脂肪酸根据双键个数的不同分为

4、单不饱和脂肪酸（MUFA）和多不饱和脂肪酸（PUFA）两种。食物脂肪中，单不饱和脂肪酸有油酸，多不饱和脂肪酸有亚油酸、亚麻酸和花生四烯酸等。人体中不能合成亚油酸和亚麻酸，必须从膳食中补充。不饱和脂肪酸根据双键的位置及功能分为ω-3系列和ω-6系列。亚油酸和花生四烯酸属ω-6系列，亚麻酸、DHA（二十二碳六烯酸）、EPA（二十碳五烯酸）属ω-3系列。植物体内不饱和脂肪酸的合成主要是指多不饱和脂肪酸的生物合成，它是在饱和脂肪酸的合成途径上扩展的，合成途径如图1.2所

5、示。在多不饱和脂肪酸的生物合成过程中，首先硬脂酸去饱和生成油酸，然后在去饱和酶的作用下油酸生成亚油酸，由亚油酸在去饱和酶作用下生成亚麻酸，而在这个去饱和的过程中有两个代谢方向，一是在Δ15-去饱和酶的作用下生成α-亚麻酸（ALA），然后经一系列的去饱和及碳链延伸反应而合成EPA（二十碳五烯酸）与DHA（二十二碳六烯酸）等生物活性较高的多不饱和脂肪酸。二是在Δ6-去饱和酶的催化作用下生成γ-亚麻酸（GLA），然后经碳链延长反应生成双高γ-亚麻酸，再经&

6、Delta;5-去饱和酶的催化作用去饱和生成花生四烯酸[6]。..第二章亚麻ω-3脂肪酸脱氢酶FAD3基因的克隆及表达载体的构建2.1试验材料2.1.1植物材料陇亚10号开花后15-20天的蒴果，由本实验室提供。2.1.2菌株和载体植物过表达载体pMDC139、pEarleyGate100与干扰载体pBIB-BASTA-35S均由兰州大学生命科学学院赵志光教授惠赠，大肠杆菌菌株DH5α及农杆菌菌株LBA4404均为本实验室保存。2.1.3主要的分子生物试剂胶纯化回收试剂盒（GelExt

7、ractionSpinKit/50）购自GENOMED生物公司；RNA提取试剂盒（RNeasyPlantKit）购自QIAGEN生物公司；质粒DNA小量提取试剂盒（AxyPrepPlasmidKit50-prerp）购自AxyGen生物公司；限制性内切酶、Q5超保真DNA聚合酶（Q5High-FidelityDNAPolymerase）购自NeeMix）购自Invitorgen生物公司。.2.2试验方法2.2.1亚麻中FAD3基因的克隆2.2.1.1亚麻总RNA的提取QIAGEN试剂盒提取准备工作：用DEPC

8、水处理Eppendorf管、枪头及所有塑料器具；用0.5mol/LNaOH处理研钵，之后180℃烘烤5-8h；用0.5mol/LNaOH浸泡电泳槽1-2h，之后用蒸馏水漂洗干净；超速离心机4℃提前预冷。注意事项：在实验过程中要佩戴一次性的PE手套，并且要经常更换，避免RNA酶的污染。同时，在操作过程中要尽量戴口罩，以防口腔中的RNA酶的污染。提取步骤如下：Step1.将100mg的植物组织迅速放入液