抗草甘膦大豆转基因PCR检测及其饲用安全研究

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1、中国农业大学博士学位论文抗草甘膦大豆转基因PCR检测及其饲用安全研究姓名：朱元招申请学位级别：博士专业：动物营养与饲料科学指导教师：李德发;王凤来20040601摘要本论文研究了RR抗草甘膦转基因大豆、豆粕及其饲料产品中外源基因的PCR检测技术以及系统评价其饲喂动物的安全性。建立大豆及其饲料产品中转基因成分的定性和定量PCR检测方法。以CTAB和GMO试制盒两种方法提取基因组DNA。用常规定性PCR对外源基因盒结构中的不同基因进行筛选或特异性扩增，对产物进行回收和酶切鉴定，最低检测下限为o．1％：在巢式PCR方法中，对大豆模板DNA的

2、检测下限可达到pg级水平；利用建立的双引物PCR技术同时检测内源和外源基因，检出来自美国、阿根廷的大豆及饲料为转基因阳性产品．取得良好效果。另外，建立了双链DNASYBRGreenI结合染料实时荧光定量PCR技术，绘制Z∞和CaMV35s基因定量扩增标准曲线方程，R2值分别达到o．9997和0．9992；对已知转基因含量的大豆标准品及大豆模拟样品进行定量，实测值与实际值相对偏差在5-11％范围之间。上述PCR方法适用于RR大豆或饲料中转基因成分的定性与定量检测。通过断奶仔猪生长试验、’生长猪消化试验和大鼠亚慢性毒性试验，评价RR抗草甘

3、膦转基冈豆粕的饲用价值和安全性。RR大豆(粕)的常规概略养分、氨基酸组成、微量元素、脂肪酸组成及胰蛋白酶抑制因子等抗营养因子含量在正常范围值内，RR豆粕对断奶仔猪的生产性能和血生理生化无明显影响。生长猪回肠末端安装T型瘘管试验显示．RR转基因豆粕粗蛋白质、氮錾酸的回肠表观消化率及回肠真消化率与常规豆粕相近；外源cp4epsps基因在生长猪肝脏、肌肉、脾脏和聃腺组织中来被检出，在食麋和粪便中的检出率均仅为6．7％。在80只Sprague·Dawley人鼠13wks的Ⅱ慢性安全性试验中，饲喂60％常规非转基因或RR转基因豆粕日粮的火鼠生k

4、与采食无显著性差异(P>0．05)；饲喂90％高含量RR豆粕的大鼠血液学、血清生化和尿液参数在生理值范围内；试验期内无大鼠死亡，大体剖捡和组织病理学检验并束发现体组织有病理学变化特征；另外，在大鼠咬肌组织未发现有外源或内源DNA残留。常规与RR抗草甘膦转基因大豆(粕)营养组成具有等价性，对断奶仔猪和生长猪有相同的营养生物学效价，对大鼠的饲用安全具有实质等同性。关键词：抗草甘膦大豆，转基因检测，PCR．饲用安全，生长性能AbstractThispaperwasconductedtostudyPCRmethodsfordetectinge

5、xoticgenesfromgeneticallymodified(GM)RRglyphosate-tolerantsoybeans，soybearlmealandfeedstuffs，andtomakeasafetyassessmentforitsapplicationinanimals．QualitativeandquantitativePCRmethodsfordetectingGMsoybeansanditsderivativefeedstuflgweredeveloped．FirstlygenomicDNAwasobtain

6、edwi也CTABmethodorkitforextractionfromGMO．AfterqualitativePCRwasusedtoscreeningandampli母differenttargetgenesintheexoticgenecassette，thePCRproductswererecoveredandcutfnrtherwiththecorrespondingrestrictiveenzyme．Thelimitofdetectionwas0．1％withqualitativePCR．WhennestedPCRwas

7、employed．aslittleasPgofsoybcantemplateDNAcouldbedetected．Basedonthedetectionwj也double—primerPCR．thesoybearlsandfeedstaffsfromAmericaandArgentinawereGMpositive．Inaddition，real—timequantitativePCRmethodwasdevelopedwitIllluorescencedyeSYBRGreen1whatcombinedtodoublerstrandD

8、NA．Thestandardcurvesof／ecandCaMV35sg：e】／lesweredrawnwithO．9997and0．9992ofR2valuerespectively．Therelativedeviat