基因枪轰击法和睾丸输出管注射法建立转基因小鼠的实验研究

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1、分类号：S813.3学校代码：10758密级：公开学号：1035020209硕士学位论文基因枪轰击法和睾丸输出管注射法建立转基因小鼠的实验研究ConstructionoftransgenicmicebytesticularefferentductinjectionandGenegun研究生姓名王鹤导师姓名及职称曹文广研究员合作导师姓名及职称学位门类级别农学硕士专业名称动物遗传育种与繁殖研究方向家畜育种所在学院动物科学学院新疆·乌鲁木齐二○一三年六月独创性声明本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的

2、研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得新疆农业大学或其他教育单位的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。研究生签名：时间：年月日关于学位论文使用授权的说明本人完全了解新疆农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：新疆农业大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子文档，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文，允许论文被

3、查阅和借阅。本人授权新疆农业大学将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以公布（包括刊登）论文的全部或部分内容。（保密的学位论文在解密后应遵守此协议）研究生签名：时间：年月日导师签名：时间：年月日本文是“十二五”转基因生物新品种培育重大专项子课题“优质转基因肉羊新品种培育”的部分研究成果（项目编号：2012ZX08008-003）基因枪轰击法和睾丸输出管注射法建立转基因小鼠的实验研究摘要转基因动物在生命科学、医学和生物制药等领域有着广泛的研究和应用前景,因此科学家们一直在探索一种更简便易行、

4、经济实用而又高效的转基因方法。为了探讨基因枪法和睾丸输出管注射法在建立转基因小鼠的可行性，我们分别进行了两个实验。实验一：基因枪轰击法在建立转基因小鼠上的实验研究。首先，挑选清洁级40日龄雄性KM小鼠20只，雌性KM小鼠60只。将需要导入的质粒eGFP-C1进行转化提取。然后准备基因枪设备，清洗发射管，清洁高压管道，准备消毒操作试剂、工具、设备。包覆DNA微弹，准备受体。最后准备金粉的清洗，DNA子弹的制作。子弹包装完成后，就开始准备基因枪轰击。我们先用基因枪轰击T293细胞,轰击后48小时观察，T29

5、3细胞出现绿色荧光，证明绿色荧光蛋白在T293细胞中表达，基因枪轰击细胞可行，可以进行下一步实验。然后开始准备基因枪轰击小鼠的睾丸，先将小鼠用腹腔注射0.1mL1%戊巴比妥钠麻醉，待小鼠麻醉后，固定四肢于木板上。将阴囊剪开一个小口，将睾丸拉出。将基因枪对准小鼠睾丸上方3-5cm处轰击。小鼠睾丸基因枪轰击后，一周以后，取小鼠睾丸培养支持细胞，以观察荧光。睾丸支持细胞培养48小时后观察出现绿色荧光，这表明eGFP-C1在小鼠睾丸的支持细胞中表达。另外取小鼠睾丸进行石蜡切片的制作，观察到曲细精管石蜡切片出现了

6、彩色荧光，进一步表明绿色荧光蛋白在小鼠睾丸曲细精管中表达。基因枪轰击小鼠睾丸10天后，挑选10只健康的小鼠和雌鼠按雌雄比例3:1合笼，待生出仔鼠后，对全部出生的小鼠提取尾尖DNA进行PCR检测，共出生小鼠314只，将这314只小鼠，全部提取尾尖组DNA织做PCR鉴定后，有12只显示阳性。阳性率为0.038﹪。通过本实验，验证了通过基因枪轰击的方法可以建立转基因小鼠。实验二：睾丸输出管注射法建立转基因小鼠的实验研究。首先，质粒EGFP-C1的转I化与提取同实验一。然后对T293细胞进行转染实验，48小时后

7、观察到绿色荧光表达非常好，可以进行下一步的实验。睾丸输出管注射用玻璃针的制作好后，可以进行注射，将注射用转染液配制好，按脂质体试剂Lipofectamine2000说明书将将载体eGFP-C1与脂质体混合。麻醉小鼠，注射时浓度一般为1%的戊巴比妥钠，腹腔注射0.1mL。找出输出管将配好的转染液注射进去，注射完后立即取一只睾丸进行石蜡切片的制作，观察到曲细精管全部变蓝，这表明转染液已经注射进入曲细精管。睾丸注射一周后取睾丸培养支持细胞，观察到绿色荧光，这表明eGFP-C1已经在小鼠睾丸支持细胞中表达。睾丸

8、注射10天后挑选健康的雄鼠10只，按雌雄比例3:1合笼。生下仔鼠后提取全部小鼠的尾尖组织DNA进行PCR检测，共产下仔鼠327只，将全部仔鼠尾尖组织提取DNA做PCR鉴定后，获得阳性仔鼠17只，转基因鼠阳性率为0.052﹪。通过本实验证明通过睾丸输出管注射法可以建立转基因小鼠。关键词：小鼠，转基因，基因枪，睾丸注射，输出管。IIConstructionoftransgenicmicebytesticularefferentductinjec