小鼠睾丸发育过程睾丸特异基因表达与不育的研究

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1、中国医科大学硕士学位论文小鼠睾丸发育过程睾丸特异基因表达与不育的研究姓名：张莹申请学位级别：硕士专业：发育生物学指导教师：闫威20090401·中文论著摘要·小鼠睾丸发育过程睾丸特异基因表达与不育的研究目的不育症是一种多病因疾病，其中男性因素造成的不育大约占所有不育症的50％。临床上，男性不育症被分为原因明确性和原因不明性，即原发性不育，两种类型。其中原发性不育症是指患者的全部检查均正常，不但致病的根本原因不明，甚至连表面原因也未找到，在临床诊断中约占75％。目前认为，原发性不育极有可能与遗传因素有关。临床上尚缺少在基因层面上对不育症的检测诊断，如果事先能确知哪些基因缺陷，那么就可

2、以针对不同的缺陷选择治疗方案。因此筛选和发现导致男性不育的基因也是进行基因治疗的基础。找到表达异常基因，从基因水平制定无创伤男性不育症患者分类的分子遗传学诊断标准，指导治疗。材料与方法一、实验材料十三个年龄段(6d，8d，lOd，12d，14d，16d，18d，20d，28d，56d，16w,24w,30w)的SPF级C57／B6小鼠睾丸组织；二、实验方法(一)RNA提取十三个年龄组的小鼠睾丸组织各取一只，液氮冻存，用TrizolReagent提取组织总RNA，并测浓度。(二)反转录多聚酶链反应(reversetranscriptasepolymerasechainreaction

3、，ImPCR)使用Promega的反转录试剂盒，50lxLRT体系，2岭RNA，去RNA酶水定容至501．tL。26。CPCR仪孵育过夜。用13-actin的引物扩增各个年龄阶段的小鼠睾丸的cDNA，调整cDNA浓度。(三)PCR扩增睾丸特异性表达基因前期工作中，我们利用电子消减杂交的手段获得小鼠睾丸组织特异表达的基因约500个，经鉴定，其中339个基因与人类同源。我们设计并合成此339个基因的引物，在小鼠此十三个年龄阶段的睾丸组织中扩增这339个基因。(四)石蜡切片，进行PAS一苏木素染色取各年龄组小鼠睾丸组织，固定于4％多聚甲醛中，常规脱水，透明，石蜡包埋，制成5岬石蜡切片，P

4、AS染色。结果该339个睾丸特异表达基因在小鼠发育不同阶段的睾丸中的表达情况共分以下几种：1．在各个发育阶段的睾丸中均表达，且亮度均匀一致，即表达量相同(共5个)2．在各个发育阶段的睾丸中均表达，但亮度不一致，即表达量不同：①表达量从发育早期睾丸到晚期递减(共2个)；②表达量从发育早期睾丸到晚期递增(共44个)；3．在各个发育阶段的睾丸中不完全表达，但亮度一致，即表达量相同(共60个)；4．在各个发育阶段的睾丸中不完全表达，但亮度不一致，即表达量不同：①从早期某阶段开始表达，表达量递增(共138个)；②从最早阶段开始表达至较晚某阶段，表达量递减(共4个)。结论1、本实验明确了睾丸组

5、织特异表达的基因2、成功扩增睾丸特异性表达的基因，并统计出表达的差异，明确了各基因在睾丸组织发育不同阶段的表达，并成功绘制了表达谱。讨论明确这些基因的时空表达对于研究精子发生和精子形成过程以及雄性生殖力都具有重要的意义。现已有几个被研究的基因，如Speml，Catsper3和Catsper4等等。可见，明确睾丸发育过程中特异基因表达的时空性，对未来后续各个基因的研究都是很重要的前期和基础工作。此外，将这些基因分类后制成cDNA芯片，2然后提取临床男性不育患者精液的IⅢA，反转录后与分类fl向cDNA芯片进行杂交，并与临床症状和病理诊断结合，进行综合分析、比较，找到表达异常基因，从基

6、因水平制定无创伤男性不育症患者分类的分子遗传学诊断标准，指导治疗。关键词小鼠睾丸发育；PCR；RT-PCR；特异性表达·英文论著摘要·ExpressionProfilingofTestis--SpecificGenesduringTesticularDevelopmentinMiceObjectiveInfertilityisal【iIldofdiseasewhichiscausedbymultiplefactorsthatamongwhichthemalefactoraccountfor50％ofallthecauses．Maleinfertilitycouldbedivided

7、intotwotypesclinicallyincludingthetypethatcauseshavebeenknownclearlyandthetypethatcausesareunknownwhichisusuallyknownasprimaryinfertility．Primaryinfertilitytakesa75％inclinicaldiagnosisthatallpatientshavenormalresultsinclinicalexaminatio