Attractin mRNA和Attractin蛋白在小鼠睾丸发育过程中的表达变化-论文.pdf

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1、数理医药学杂志2014年第27卷第3期文章编号：1004—4337(2014)03—0275—03中图分类号：Q492．4文献标识码：A·基础医学研究·AttractinmRNA和Attractin蛋白在小鼠睾丸发育过程中的表达变化△明钰熊承良(武汉轻工大学医学技术与护理学院武汉430023)摘要：目的：通过定量检测和比较Attractin(Atrn)mRNA和Atrn蛋白在小鼠睾丸发育过程中的动态变化，为进一步研究Atrn在睾丸的生理作用提供实验依据。方法：用相对定量法检测AtrnmRNA在生后1、5、10、15、21、28、35、

2、42、56和120天龄小鼠睾丸发育过程中的表达变化，并用Westernblot方法检测各天龄小鼠睾丸Atm蛋白表达。结果：AtrnmRNA和Atm蛋白在小鼠睾丸发育过程中的表达变化趋势相似，在生后第1天两者均有表达，但是处于相对较低水平，此后是一个逐渐增高的过程，在28天出现较明显上调。在这之后，两者表达变化出现差异。AtrnmRNA在生后28~35天表达最丰富，随后稳定于这一水平，Atrn蛋白表达则是继续增加直至成年。结论：Atrn参与精子发生的启动、精原干细胞的增殖分化、精母细胞的减数分裂和精子形成等过程，并有助于Leydig细胞

3、进一步成熟。关键词：Attractin；小鼠；睾丸；实时定量逆转录多聚酶链反应doi：10．3969／j．issn．1004-4337．2014．03．009我们前期研究结果发现，在成年小鼠睾丸组织，Atm蛋白录所得cDNA作为模板用于荧光定量PCR，按参考文献[3]进表达于精原细胞、精母细胞、精子细胞、Sertoli细胞、Leydig细行。产物经1．5琼脂糖凝胶电泳分析。脑组织cDNA以1O胞和管周肌样细胞口]，并且纯合子Atrn无效突变雄性小鼠体倍系列稀释制作标准曲线，根据标准曲线确定检测标本的内生殖激素发生改变[2]，这些提示A

4、trn在雄性生殖系统发挥mRNA量。各天龄小鼠睾丸AtrnmRNA的量是以13-Actin一定作用。本实验应用实时定量RT_PCR(real-timequantita—mRNA为内参标准化的相对量，并设120天龄小鼠睾丸相对tiveRT-PCR)方法和WesternB1Ot方法分别检测Attractin表达量为1．0。mRNA和Attractin蛋白在生后小鼠睾丸发育过程中的表达1．3．2WesternBlot检测各天龄小鼠睾丸Atrn蛋白的表达变化，有助于进一步研究Atrn在睾丸的生理作用和生化功各天龄小鼠睾丸组织总蛋白用RIPA裂

5、解液提取。BCA能。蛋白测定试剂盒检测蛋白浓度。3～8NuPAGE~NovexTris-AcetateGels电泳分离蛋白，XCeUIITMBlotModule转1材料与方法移蛋白至PVDF膜(30V，1h)。封闭后，加一抗(工作浓度1．1实验动物1：looo)，洗膜后加入二抗。用化学发光试剂盒显示反应条性成熟雄雌性昆明小鼠按1：2比例夜间合笼交配，合笼带。将Atrn蛋白的相对含量，以其胶片上条带光密度与同一10h内查阴栓，雌鼠查得阴栓后单独饲养以获得各天龄小鼠。泳道中fl-Actin蛋白条带光密度的比值表示，并设120天龄小以出生当

6、天记为第1天，分别取第1，5，10，15，21，28，35，42，鼠睾丸相对表达量为1．0。56，120天小鼠用于实验，每组天龄小鼠各3～5只。2结果1．2实验试剂Trizol和SYBRGREENI(Invitrogen)、RIPA(Cel1Sig—2．1AtrnmRNA在小鼠睾丸发育过程中的表达变化nalingTechnology)、3～8NuPAGE~NovexTris-Acetate本实验特异性地扩增出Tm为87．6℃的单一产物，琼脂Gels(Invitrogen)，兔抗Atrn多克隆抗体由斯坦福大学医学院糖凝胶电泳显示为单一、

7、特异扩增条带，大小154bp，与预期产遗传研究室Dr．G_SBarsh和沈士亮博士惠赠。物片断大小一致。小鼠出生后第一天睾丸组织中可检测到1．3实验方法AtrnmRNA表达，此后逐步上调，至生后28天达到最高水1．3．1实时荧光定量RT-PCR检测各天龄小鼠睾丸组织At—平，之后稳定在这一水平直到成年(图1)。rnmRNA表达用Trizol提取各天龄小鼠睾丸组织和性成熟小鼠脑组织总RNA，按试剂盒说明书进行RT反应。逆转收稿日期：2014—04-02△基金项目：国家自然科学基金资助项目(30570679)；武汉轻工大学引进人才科研启动

8、项目(2O13RZ13)*华中科技大学同济医学院计划生育研究所JournalofMathematicalMedicineV01．27No．32014AtrnmRNA在生后28~35天表达最丰富，随后稳定于这一水平，Atr