基于基因枪轰击法、睾丸输出管注射法之转基因小鼠实验研究

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1、基于基因枪轰击法、睾丸输出管注射法之转基因小鼠实验研究第1章文献综述1.1转基因动物的研究进展动物转基因技术是通过基因工程技术将外源基因随机或定点整合到受体动物的基因组中并使外源基因表达和遗传的生物技术。该技术在在医学、生命科学、生物制药等领域有着广泛的研究和应用前景。目前常用的制备转基因动物的方法包括显微注射法、逆病毒载体转染法、脂质体介导转基因法、电穿孔、磷酸钙法等。但是这些方法都存在一定的缺点，需要进一步克服。显微注射法是采用较为广泛，较早应用于转基因制作的一种方法，但是它要求操作人员具有很好的操作技能，

2、且操作过程速度较慢；病毒转载体染法虽然借着病毒载体可以实现目的基因迅速有效地转入宿主基因组中，但因其存在一定的安全隐患，可能会改变细胞的表现型及带来生物安全性方面的问题；脂质体介导转基因法虽然简单有效，但对细胞有一定的毒性，被转染的DNA也有一定的局限性且费用昂贵；电穿孔要求细胞处于悬浮状态，它依赖于一定的细胞类型和特殊的条件，能够同时转染多个细胞，使得这种方法相对来说效率较高；磷酸钙法简单便宜但是效率较低。这些方法大多数要求细胞能够迅速分裂，因此不能应用于已经末端分化的细胞，例如神经细胞等。目前，科学家们一直

3、在探索一种高效及靶向的转基因手段。精原干细胞法、RNA干扰介导的基因沉默技术、锌指核酸酶介导的基因打靶技术，Talen靶向基因敲除技术等近年来出现的新技术可以进一步提高转基因效率及转基因的精确性。1.2制备转基因动物的一般方法1.2.1显微注射法1980年，Gordon[1]等人用显微操作的方法将外源的基因注射入受体动物的受精卵中，从而使外源的基因整合到在受体的细胞染色体中。然后移植到受体动物的子宫中进行发育，但最终因为条件有限，而没有能生产出的转基因动物。但是这种转基因方法给以后的科研发展提供了重要的技术途径

4、。显微注射法是通过显微操作以的运用，将外源的基因通过显微操作仪注射到受体的受精卵或者胚胎中，再将受精卵或者胚胎移植进入受体动物的子宫进行发育，最终生产出转基因动物的方法。随着分子生物学技术的迅速发展，1982年，Palmiter等[2]人首次成功的将人的生长激素基因，注入到小鼠的受精卵中，获得了表达该外源基因的转基因超级鼠，这种新型的转基因超级鼠比普通的对照组小鼠生长速度快2倍以上，体型大一倍，这就为以后培育转基因动物开拓了思路，提供了技术路线。后来，1985年，Brem等[3]培育出了转基因兔，Hammer等

5、[4]培育出了转基因猪，1989年，Roschlau等[5]培育出了转基因牛。第2章基因枪法建立转基因小鼠的实验研究2.1实验材料随着生物技术的发展，基因的改良得到广泛的应用。目前，在多个物种上开展了转基因动物、植物的研究。而基因枪由于操作简单、使用方便，效率较高得到了较广泛的应用。基因枪在应用于植物、动物细胞或成体外源基因的导入上，并取得一定的进展。作为一种比较方便的转基因手段，应用于转基因动植物。清洁级40日龄雄性KM小鼠20只，雌性KM小鼠60只。购自北京华阜康生物科技股份有限公司。胰酶购自Gibco（1

6、5050），胎牛血清购自Hyclone公司(SH30370.03)，DMEM购自Neuronbc公司（08-019），戊巴比妥钠购自Sigma，NaC（lS5886-500G）、KC（lP5404-500G）和KH2PO4（P5655-100G）均购自Sigma，基因组提取试剂盒购自天根公司，Taq酶购自TaKaRa（DR001A），质粒大提试剂盒购自Promega。第2章基因枪法建立转基因小鼠的实验研究.....122.1实验材料........122.2实验方法.......122.3结果与分析......

7、...202.4讨论.......222.5结论.........25第3章睾丸输出管注射法建立转基因小鼠的实验研究........263.1材料和方法.........263.2结果与分析.........333.3讨论.........373.4结论....38第4章全文结论.....39第3章睾丸输出管注射法建立转基因小鼠的实验研究本试验用显微注射针将脂质体包裹的质粒载体eGFP-C1，通过睾丸的输出小管注射到KM白小鼠的曲细精管中，成功将外源基因导入睾丸组织，旨在探索一条新的、简单可行的建立转基因动物的

8、途径。按脂质体试剂Lipofectamine2000说明书将将载体eGFP-C1与脂质体混合[55]。具体操作过程如下，转染液A制备：将4μg质粒加到100μL无菌、无血清的Opti-MEM培养液中，并轻轻混匀。转染液B制备：将10μl脂质体Lipofectamine2000与100μL无菌、无血清的Opti-MEM培养液混匀，室温放置5min。随后将A液与B液