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1、小鼠睾丸输出管注射法建立转基因小鼠试验探究摘要：应用玻璃针将脂质体包裹的质粒pEGFP-Cl通过睾丸输出管注射到4周龄昆明（KM）小白鼠睾丸曲精细管内。共注射6只小鼠，其中一只注射后马上做石蜡切片观察转染液注射入曲细精管内的情况，其他5只继续饲养，1周后取1只小鼠培养睾丸的支持细胞，观察是否有荧光出现。4周后，用PCR法检测剩余4只小鼠睾丸组织曲细精管基因组中的外源DNA,4只都显示为阳性。表明用睾丸输出小管注射法将外源基因导入小鼠睾丸是一条简便可行的新途径。关键词：小鼠；转基因；睾丸输出管注射法中图分类号：S865.1文献标识码：ADOI编码：10.3969/j.issn.1006-65
2、00.2013.04.008ConstruetionofTransgenicMicebyTesticularEfferentDuctInjectionWANGHel,2,CAOWen-guang2（1.CollegeofAnimalScience,XinjiangAgricultureUniversity,Urumqi,Xinjiang830052,China；2.InstituteofAnimalScience,ChineseAcademyofAgriculturalSciences,Beijing100193,China)Abstract：Usingglassneedleplasmid
3、pEGFP-Clliposome-encapsulatedwasinjectedintothetesticularefferentof4weeksmaleKMmice・Doimmediatelyafteraninjectionofparaffinsectionstoobsernethetransfectionsolutionwasinjectedintotheseminiferoustules,remanentmousetocontinuetoraise,afteraweek,takeonemousecultivatingtesticularsertolicells.Afterfourwe
4、eks,exogenousDNAinthePCRmethodfordetectingtheremainingfourmousetestisseminiferoustubulesgenome,allaspositive・TheresuItindicatedthatthedotainthisstudytotransgenicanimalscouldbeestablishedbytesticularefferentinjection.Keywords:mice；transgenic；testisefferentinjection转基因动物在生命科学、医学、生物制药等领域有着广泛的研究和应用前景，
5、因此，科学家们一直在探索一种更简便易行、经济实用而又高效的转基因方法。有研究者应用曲细精管微注射法建立了转基因动物［1-4］,该方法只需注射、交配、检测3个步骤，简便易行。精原干细胞的移植首先由Brinstre等［5］报道，他们先将可育小鼠的混合生精细胞移入不育小鼠的曲细精管，结果在受体睾丸内产生了具有受精能力的精子。目前，利用雄性动物生殖细胞建立转基因动物的方法成为许多科学家关注的对象。将携带外源基因的转染液注射到睾丸曲细精管中[6],体内直接转染生殖细胞,产生转基因精子，通过动物自然交配最终获得转基因动物。这种体内转染的方法简单，易于操作，产生转基因动物周期短，制备环节少。就目前而言，
6、最大的优点是成功避开了体外培养生殖干细胞的困难。本试验用显微注射针将脂质体包裹的质粒载体pEGFP-Cl,通过睾丸的输出小管注射到KM白小鼠的曲细精管中，成功将外源基因导入睾丸组织，旨在探索一条新的、简单可行的建立转基因动物的途径。1材料和方法1.1材料1.1.1试验动物清洁级40日龄雄性KM小鼠6只，购自北京华阜康生物科技股份有限公司。1.1.2主要试剂质粒pEGFP-Cl（本实验室留存）。质粒提取试剂盒购于美国Promega公司。脂质体lipofectamine2000购自Invitrogen公司。台盼蓝、DMEM培养基、Opti-MEN培养基购自Gibco公司。引物合成由上海生工生物
7、工程公司完成。动物组织DNA基因组提取试剂盒购自天根生化科技有限公司。其它试剂均为国产分析纯。1.1.3试验器材体视解剖镜，玻璃管（100X0.1mm）,酒精灯，打火机，ImL的注射器，手术器械（用前需消毒）,台盼蓝（0.4%）,生理盐水稀释的戊巴比妥纳（注射时浓度一般为1%)01.2方法1.2.1质粒的转化提取pEGFP-Cl转化入空白感受态菌种，铺板并用卡那霉素筛选后，挑取阳性克隆，大量培养，用Promega质粒提取
