多西环素对人小细胞肺癌h446细胞的抗肿瘤作用及其机制研究

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1、南方医科大学2010级博士学位论文多西环素对人小细胞肺癌H446细胞的抗肿瘤作用及其机制研究Theanti·tumoreffectsandthepossiblemechanismsofDoxycyclineonH446Cells课题来源：自选学位申请人导师姓名专业名称培养类型培养层次所在学院宋志华李国锋药理学非定向博士研究生药学院2013年6月2日广州博士学位论文多西环素对人小细胞肺癌H446细胞的抗肿瘤作用及其机制研究背景和目的摘要肺癌是临床发病率最高的恶性肿瘤，其死亡率居于各种恶性肿瘤之首，且全世界肺癌发病率还在以每年0．5％的速度增长。仅有20％．

2、30％的肺癌患者可以早期得以诊断。尽管肺癌的诊断和治疗手段不断取得新的进展，但由于肿瘤转移及多药耐药等问题，肺癌患者预后仍不佳，五年生存率仅为8．15％。中国也己成为世界上第一肺癌大国。按组织学类型可将肺癌分为两大类：小细胞肺癌和非小细胞肺癌。小细胞肺癌占肺癌总数的16％，且更具侵袭性，在早期就能扩散到其它器官，且往往伴有骨转移。目前肺癌的综合治疗措施仍是以手术为主，化疗、放疗为辅。化疗是目前治疗中、晚期肿瘤的主要手段，缺点是对瘤体细胞产生杀伤作用的同时，对正常组织细胞也同样产生杀伤作用，特别是对生长迅速的血细胞、骨髓细胞等损害更大。化疗严重的副作用对患

3、者的生活质量有很大的影响。由于肺癌发现时多为晚期，许多病人已丧失了手术机会，同时化、放疗耐受现象又较严重，预后很差。因此寻求新的有效的肺癌治疗药物，进一步提高临床疗效，己成为厄待解决的临床难题之一。多西环素是四环素类抗生素，其分子式为C22H24N20。，分子量为444．435。具有抗炎、抗菌、神经保护等广泛的药理作用。新近研究报道其对于多种肿瘤具有一定的细胞毒作用，包括舌癌、前列腺癌、直肠癌等。目前多西环素对小细胞肺癌细胞是否有抑制作用的研究尚未见报道。本实验通过研究多西环素对小细胞肺腺癌细胞系NCI．H446增殖、凋亡、侵袭和转移的影响，并探讨其潜在

4、的摘要作用机制，以期为深入阐明多西环素的抗肿瘤机制提供实验基础，为多西环素应用于临床治疗肺癌提供理论依据。方法(1)探讨多西环素对体外人小细胞肺癌H446细胞增殖的影响及其机制。①建立人小细胞肺癌H446细胞培养体系；多西环素作用于小细胞肺癌H446细胞一定时间段后，光镜下观察细胞形态学变化；②应用CCK-8法对各组细胞增殖抑制率进行检测，共设2．5I-tg／ml、5I．tg／ml、10斗咖1、20,g／rrd、40pg／ml5个浓度梯度，并设24、48、72、96小时共4个时间梯度；选用25I．tg／ml的5．氟尿嘧啶作为阳性对照药物，同时设置空白对照

5、组(不加药)，检测各组相对生存率，计算增殖抑制率③平板克隆形成实验检测药物处理后各组的克隆形成率；(2)探讨多西环素对人小细胞肺癌H446细胞调亡的影响。①多西环素作用于H446细胞后，以Hoechst33258染色后，荧光显微镜下观察细胞微观结构的变化。②Tunel染色法检测细胞凋亡并计算凋亡指数⑧AnnexinV．FITC／PI染色流式细胞术对药物(O、5rtg／ml、10I．tg／ml、20I_tg／ml的多西环素及阳性对照药物氟尿嘧啶)作用后H446细胞的早期调亡率进行检测。(3)探讨多西环素诱导人小细胞肺癌H446细胞凋亡的可能机制。以不同浓度

6、的多西环素作用于H446细胞后，①采用Westernblot法检测药物作用后H446细胞内凋亡相关蛋∈IBax、Bcl．2、caspase3、survivin表达水平的变化；②采用Real-timePCR技术检测多西环素药物刺激对细胞内Bax、Bcl．2、caspase3、survivin的mRNA表达水平的影响。(4)探讨多西环素是否具有抑制人小细胞肺癌H446细胞迁移和侵袭的能力。①采用细胞划痕实验通过测量迁移距离评价多西环素对H446细胞的迁移能力的影响②采用Transwell实验观察多西环素对H446细胞的侵袭能力的影响。(5)探讨多西环素影响人

7、小细胞肺癌H446细胞侵袭作用的机制：①采用ELISA法检测各组细胞上清液中基质金属蛋白酶MMP．2、MMP．9及组织基质金属蛋白酶抑制剂TIMP．2的浓度水平②采用ELISA法检测各组细胞上清液中血管TT博士学位论文内皮生长因子VEGF的水平。(6)统计方法：结果数据以均数士标准差(xIs)表示。采用SPSSl3．0软件进行数据分析。随机设计的多样本资料进行单因素方差分析(One．wayANOVA)多重比较时，方差齐性时，选择LSD法，方差不齐时选择近似F检验Welch法，多重比较方法选择Dunnett’ST3法。P<0．05时认为有统计(学)差异。结

8、果(1)不同浓度的多西环素(2．5I-tg／ml、5lxg／ml、10I_tg／