ciapin1在人肺癌组织中的表达及其对人小细胞肺癌ncih446细胞生长的影响

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1、CIAPIN1在人肺癌组织中的表达及其对人小细胞肺癌NCIH446细胞生长的影响【摘要】目的:探讨新基因CIAPIN1在人肺癌和癌旁正常组织中的表达差异及该基因导入对人小细胞肺癌NCIH446细胞生长的调控作用。方法:采用免疫组化方法检测51例石蜡包埋的肺癌及癌旁正常肺组织中CIAPIN1蛋白的表达;构建腺病毒载体介导CIAPIN1基因(AdCIAPIN1),转染到自身CIAPIN1低表达的人小细胞肺癌细胞系NCIH446,)分析细胞周期及细胞凋亡的变化。结果:癌旁正常肺组织中CIAPIN1基因蛋

2、白阳性表达率（100%）明显高于肺癌组织中表达率（39.2%,P<0.05）;与对照组相比,腺病毒介导的CIAPIN1实验组能迅速抑制NCIH446细胞的生长(P<0.01),诱导细胞发生凋亡,并出现明显的G1/S期阻滞现象。结论:肺癌组织中CIAPIN1基因表达下调可能与肺癌发生密切相关,AdCIAPIN1转染NCIH446细胞能明显抑制肿瘤细胞的生长,提示CIAPIN1基因可能是一个新的抑癌相关基因。【关键词】CIAPIN1基因腺病毒肺癌细胞凋亡抑制CIAPIN1(cytokinei

3、nducedapoptosisinhibitor1),又称anamorsin,一个最新被证实和凋亡相关的分子,其基因定位于16号染色体长臂。Shibayama等［1,2］最早证实CIAPIN1是独立于凋亡调节分子Bcl2家族、caspase家族等之外的RAS信号转导通路中的一个新调节分子。新近研究发现,CIAPIN1广泛分布于胎儿和成人的正常组织中,特别是在分化型组织和活性代谢组织中具有高表达［3］,但是在某些癌症发生时表达受抑［4］,提示CIAPIN1基因的表达与肿瘤的发生发展有密切联系。腺病毒作为目

4、的基因转移的载体,具有安全、宿主细胞广泛、感染靶细胞效率高、制备和转导方便等优点,而且由于腺病毒亲肺部的特性,腺病毒广泛用于肺部疾病的治疗［5,6］。本实验针对小细胞肺癌基因治疗研究的特点,首先从组织水平研究CIAPIN1表达与人肺癌发生的关系;其次在构建腺病毒载体介导的CIAPIN1基因(AdCIAPIN1)转染人小细胞肺癌细胞系NCIH446中,进一步观察其对肺癌细胞生长、细胞周期及凋亡的影响。为研究CIAPIN1基因表达变化在小细胞肺癌中的作用及其效应机制提供实验依据。　　1材料和方法　　1.1

5、材料　　NCIH446:人小细胞肺癌细胞系,由本室保存;胎牛血清购自Sigma公司;RPMI1640、DMEM培养基干粉购自Gibco公司。免疫组化SABC试剂盒购自博士德生物工程有限公司。全组共51例石蜡包埋肺癌组织及相应癌旁正常肺组织标本,来自第四军医大学唐都医院胸外科2005-10/2007-06经病理证实的手术病例。其中鳞癌20例,腺癌20例,小细胞肺癌11例;年龄39～78岁(男35例,女16例)。取标本前所有病例均未行放疗、化疗和生物反应调节剂治疗。　　1.2方法　　1.2.1细胞培养和传代

6、　　NCIH446培养条件:在37℃、50mL/LCO2培养箱中,用含100mL/L胎牛血清的RPMI1640培养液培养（青霉素和链霉素各100U/mL）;2.5g/L胰蛋白酶消化传代。293细胞:腺病毒E1基因转化的人胚肾细胞系。培养条件:37℃、50mL/LCO2培养箱中,用含100mL/L胎牛血清的DMEM培养液培养。　　1.2.2免疫组化SABC方法　　采用SABC免疫组化法进行分析,试验所用载玻片均经PolyLysine防脱片剂处理。抗原修复方法为微波炉加热0.01mol/L枸橼酸盐缓冲液至

7、沸腾,然后放入切片,95℃加热5min,断电后等缓冲液自然冷却至室温后再取出切片,PBS液冲洗3次,每次2min。以郝志强等纯化的小鼠CIAPIN1蛋白的单克隆抗体（mAb）作为一抗,稀释度为1∶2000,生物素化山羊抗小鼠IgG作为二抗,稀释度为1∶500,CIAPIN1已染出的胃癌切片做阳性对照。以0.01mol/LPBS代替一抗作为阴性对照。判定标准:阳性显色为肿瘤细胞核和(或)胞质被染成褐黄色、呈现粗细不等、深浅不一的颗粒状。CIAPIN1蛋白阳性细胞分为3级:CIAPIN1(-):癌细胞无着色,

8、CIAPIN1(+):癌细胞核呈棕色颗粒状,着色癌细胞核所占比例<25%,CIAPIN1():着色细胞核呈棕色颗粒状,数量≥25%。　　1.2.3重组腺病毒的构建和基因转染　　重组CIAPIN1基因的腺病毒AdCIAPIN1及用作对照的GFP重组体腺病毒AdEGFP由本研究组李晓华博士构建［4］,均为复制缺陷型腺病毒。在293细胞中进行扩增繁殖及纯化后,采用Qbiogene公司的TCID50法测定病毒滴度。用含10