旋毛虫致人小细胞肺癌h446细胞凋亡的分析

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1、中文摘要旋毛虫对人小细胞肺癌H446细胞凋亡的研究摘要肺癌是目前临床中最常见的恶性肿瘤之一，在我国大城市其发病率已占恶性肿瘤之首，且发病呈上升趋势。其中小细胞肺癌约占肺癌发病总数的20%，恶性程度高，倍增时间短，转移早而广泛，很多病例确诊时已属晚期，手术的机会大为减少，所以临床治疗选择放化疗为主。近些年国内外研究发现，多种抗肿瘤活性物质存在于多种生物中，一些寄生虫也具有明显的抗肿瘤作用。文献主要报道的有旋毛虫[1]、疟原虫[2]、棘阿米巴滋养体[3-4]、刚地弓形虫[5]等。并陆续报道旋毛虫能抵抗黑色素

2、瘤、结肠癌、肝癌、胃癌、肉瘤、白血病、纤维素瘤、骨髓瘤、乳腺癌等[6-9]。目前小细胞肺癌的化疗把顺铂列为标准化疗药物,毒副作用较多且容易继发耐药。因此寻求新的小细胞肺癌治疗方法有助于提高小细胞肺癌的防治水平。已有报道，旋毛虫抗肿瘤活性物质多来源于旋毛虫的不同抗原，根据旋毛虫来源部位不同将旋毛虫分为表面抗原、排泄分泌抗原及虫体可溶性抗原，且有研究表明，表面抗原、排泄分泌抗原蛋白组分复杂为主要的抗原[10]。王学林等[11]发现，旋毛虫虫体蛋白对多种肿瘤细胞均有抑制作用。旋毛虫肌幼虫排泄分泌蛋白是培养旋毛

3、虫肌幼虫提取其排泄分泌物而获得的一种生物活性物质，为了证实其对小细胞肺癌有抑制作用，我们采用体外培养的方法观察旋毛虫肌幼虫排泄分泌蛋白对H446细胞的作用。目的：研究旋毛虫肌幼虫排泄分泌蛋白对H446小细胞肺癌的抑制作用，确认其对H446小细胞肺癌细胞的抗肿瘤活性。进一步观察旋毛虫分泌蛋白对H446小细胞肺癌细胞凋亡的影响，探讨其与相关凋亡基因及蛋白的关系。方法：1.人小细胞肺癌H446细胞株(由中国医科大学郑华川教授赠送)，1中文摘要用含10%的优级胎牛血清(TBD)做传代培养。2.实验分组：分为对照

4、组和不同浓度旋毛虫排泄分泌蛋白组。阳性对照组：用不含胎牛血清的RPMI-1640培养液将顺铂稀释成（12.8μg/ml、6.4μg/ml、3.2μg/ml、1.6μg/ml、0.8μg/ml、0.4μg/ml、0.2μg/ml）不同浓度分别培养H446细胞；实验组，旋毛虫排泄分泌蛋白组：分别用不含FBS的RPMI-1640培养液将提取的旋毛虫排泄分泌蛋白配制成的终浓度0.75mg/ml，0.15mg/ml，0.3mg/ml的旋毛虫排泄分泌蛋白培养液，处理细胞；同时设立阴性对照组：用含10%FBS完全培养

5、基培养H446细胞。3.采用四唑盐比色(MTT)方法，观察旋毛虫排泄分泌蛋白及顺铂分别作用于人小细胞肺癌0h、12h、24h、36h、48h、72h后对增殖活性的影响。4.采用TUNEL法检测不同处理后细胞凋亡情况，分别给予浓度为0.15mg/ml的旋毛虫肌幼虫排泄分泌蛋白处理、浓度为6.4μg/ml的顺铂处理、及不给予任何药物处理24小时后检测细胞的凋亡。5.采用荧光免疫细胞化学法观察旋毛虫排泄分泌蛋白及顺铂作用于人小细胞肺癌H446细胞c-myc蛋白的表达。6.采用蛋白印迹(Western-blot

6、)技术检测人小细胞肺癌H446细胞c-myc蛋白的表达。7.用反转录PCR（RT-PCR）技术检测人小细胞肺癌H446细胞Bcl-2mRNA、fas/faslmRNA的表达。8.数据统计分析：应用SPSS17.0统计学软件，对结果进行单因素方差分析，用LSD-t检验行两两比较，P<0.05表示差异有统计学意义。结果：1.旋毛虫排泄分泌蛋白及顺铂对小细胞肺癌细胞增殖活性的影响1.10.075mg/ml，0.15mg/ml，0.3mg/ml浓度的旋毛虫排泄分泌蛋白分别处理0h、12h、24h、36h、48h

7、、72h后，H446细胞的生长受到明显的抑制，且在一定的时间和浓度范围内呈时间、浓度依赖性，经过统计学分析，各组之间差异均具有统计学意义(P<0.01)。1.2不同浓度的顺铂分别与H446细胞共培养0h、12h、24h、36h、48h、72h后，H446细胞的生长受到抑制，且一定时间和浓度范围内与时间浓度正相关，经统计学分析，各组之间存在差异且有统计学意义(P<0.01)。2.经TUNEL法检测凋亡细胞，正常培养组未见到凋亡细胞(图3)，被2中文摘要染成棕黄或者棕褐色的细胞为凋亡细胞，紫染的为活细胞；顺

8、铂作用组可见到凋亡细胞(图5)；旋毛虫肌幼虫排泄分泌蛋白作用组可见到大量的凋亡细胞(图4)。经统计软件分析，3组相比差异均有统计学意义(P＜0.01)；旋毛虫肌幼虫排泄分泌蛋白作用组更显著且有统计学意义(P＜0.01)。3.应用荧光免疫细胞化学染色法检测，在0.3mg/ml浓度的旋毛虫排泄分泌蛋白作用下，连续培养48h，经免疫细胞化学染色法检测，人小细胞肺癌可见c-myc阳性表达，阳性染色主要定位于胞浆，阴性对照组细胞浆着色很深，胞浆呈现清