real-time pcr检测感染宿主血清日本血吸虫dna水平动态变化及其在血吸虫病诊断和疗效考核中的意义

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1、硕士学位论文论文题目Real-timePCR检测感染宿主血清日本血吸虫DNA水平动态变化及其在血吸虫病诊断和疗效考核中的意义官威研究生姓名夏超明指导教师姓名病原生物学专业名称感染与核酸分子诊断研究方向2013-6-18论文提交日期Real-timePCR检测感染宿主血清日本血吸虫DNA水平动态变化及其在血吸虫病诊断和疗效考核中的意义中文摘要中文摘要第一部分日本血吸虫Taqmanreal-timeqPCR法的建立目的：建立一种灵敏、高效的日本血吸虫Taqmanreal-timePCR定量检测法，并

2、评价其特异性与敏感性。方法：以日本血吸虫高度重复基因SjR2为靶序列设计引物和Taqman探针，收集日本血吸虫、曼氏血吸虫、肝吸虫、旋毛虫以及肺吸虫成虫，并抽提不同成虫模板，将普通PCR扩增的日本血吸虫SjR2产物纯化克隆，用real-timePCR法进行扩增。结果：曼氏血吸虫、肝吸虫、旋毛虫、肺吸虫成虫模板扩增曲线均在阈值水平以下，只有日本血吸虫扩增曲线在阈值线以上，并呈指数状分布。将以上各样本扩增产物进行2%琼脂糖凝胶电泳，只有日本血吸虫泳道出现77bp特异性目的条带；将日本血吸虫SjR2基

3、因重组质粒连续10倍稀释11个梯度，可检测到质粒最小浓度为4.47×10copies/μl，其标准曲线回归方程y=-3.0987x+49.158，相关系数为0.9965。结论：Taqmanreal-timePCR检测法敏感度高、特异性强，具有潜在的应用价值。第二部分Real-timePCR法对日本血吸虫感染家兔血清DNA的定量检测及感染度的评价目的：评价real-timeqPCR法应用于日本血吸虫感染宿主血清DNA的早期诊断价值，并探索宿主血清DNA动态变化规律及感染宿主血清DNA水平与感染度的

4、相关性。方法：双性感染家兔模型的建立：分别感染30、50、100、200和500条日本血吸虫双性尾蚴；单性感染家兔模型的建立：感染日本血吸虫单性尾蚴200条。收集每只家兔感染后3d~7w外周血清，通过real-timePCR法检测。I中文摘要Real-timePCR检测感染宿主血清日本血吸虫DNA水平动态变化及其在血吸虫病诊断和疗效考核中的意义结果：real-timePCR法从感染后3d的血清模板中即可扩增到阳性产物，其早期检测阈值为54.36个拷贝数；在日本血吸虫双性尾蚴感染的模型中，宿主血清

5、DNA浓度呈上升趋势，且感染5w以后血清DNA浓度明显升高，特别是感染家兔血清DNA水平与感染度呈显著正相关，可用于感染度的评价。结论：real-timePCR法敏感性高、特异性好，除具有诊断价值外还可以根据检测的阈值，评价宿主感染度，为进一步应用于日本血吸虫病的诊断及疗效考核提供了新的检测方法。第三部分Real-timePCR法对日本血吸虫感染家兔血清DNA检测用于短期疗效考核的评价目的：探索单、双性感染宿主经吡喹酮治疗后宿主血清DNA的动态变化评价real-timeqPCR法应用于日本血吸虫

6、病的短期（6个月内）疗效考核价值。方法：建立分别感染200条双性尾蚴和200条单性尾蚴的家兔模型，感染后7w、8w先后2次各按150mg／kg体重的剂量给予每只兔子吡喹酮杀虫治疗(顿服)。收集治疗后1d~1w(每天)、2w~23w(每周)外周血清，以real-timePCR法进行检测。结果：在双性感染200条尾蚴的家兔模型中，real-timePCR法从治疗后1d~1w及2w~17w的家兔血清中均能检测到日本血吸虫特异性目的基因，转阴阈值为49.29拷贝，治疗后一周内宿主血清DNA浓度每日检测结

7、果呈逐步上升趋势，治疗一周以后血清DNA浓度逐渐下降；在感染200条单性尾蚴的家兔模型中，治疗后一周内宿主血清DNA浓度同样呈逐步上升趋势，随后DNA浓度逐渐下降，并在治疗后第5w血清DNA的检测结果转为阴性，其转阴阈值为1784.25拷贝，与双性感染组治疗后第9w检测的血清DNA浓度(1846.24拷贝)相当。结论：对比单、双性感染组治疗后血清DNA定量检测结果显示，双性感染的家兔血清DNA在治疗后第9w时的浓度为1846.24拷贝，与同步单性感染组血清DNA第5w转阴时的阈值（1784.25

8、拷贝）相当。提示此时双性感染宿主血清虫体DNA已转阴，此时间节点可作为疗效考核时间，而无需等到血清DNA完全转阴。研究结果表明，real-timePCR法对日本血吸虫感染宿主血清虫体DNA的定量检测IIReal-timePCR检测感染宿主血清日本血吸虫DNA水平动态变化及其在血吸虫病诊断和疗效考核中的意义中文摘要应用于疗效考核，可缩短疗效考核的时间节点更适宜于血吸虫病流行区现场应用。第四部分Real-timePCR法对血清DNA定量检测用于日本血吸虫病人的诊断及感染度的评价目的：评价real-t