vegf基因修饰msc移植促进放射性脑损伤后脑微血管新生实验的研究

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1、中山大学博士学位论文VEGF基因修饰MSC移植促进放射性脑损伤后脑微血管新生的实验研究姓名：张付生申请学位级别：博士专业：神经病学指导教师：邢诒刚20090518中山大学博一l等位论文VEGF基因修饰MsC移植促进放射性脑损伤后脑微血管新生的实验研究VEGF基因修饰MSC移植促进放射性脑损伤后脑微血管新生的实验研究专业：神经病学博士研究生：张付生导师：邢诒刚教授中文摘要放射性脑损伤(radiationinjuries，brain：RIB)是头颈部恶性肿瘤放射治疗后常见的中枢神经系统并发症，原发肿瘤在得到

2、放射治疗的同时，RIB的出现成为限制脑部放射剂量、影响疗效和降低病人生存质量的重要因素。目前临床对RIB治疗以抗氧化、脱水剂、激素及对症支持治疗为丰，无法从根本上逆转其病情变化，所以寻找有效的治疗方法十分必要。本课题组前期实验曾尝试碱性成纤维生长因子(bFGF)转染C17．2神经干细胞移植治疗，发现对RIB有一定的治疗作用。引起RIB特别是晚期RIB的病理机制尚未完全阐明，近年来对放射性脑病发生机制的研究丰要集中在血管内皮细胞损伤和血脑屏障破坏方面。血管擘各成分中以内皮细胞对放射线最敏感。有研究显示，单

3、次大剂量照射后24小时就可见内皮细胞凋亡损失，这种损失可以持续52周，最后导致40％"-'65％的血管内皮损失。大量的内皮细胞损失导致微血管床破坏，伴随微血管床破坏是微循环的明显障碍，并导致脑的供血供氧减少，最终出现脑细胞坏死、脱髓鞘等病理改变。特别是侧支循环不发达的白质，可出现片状白质坏死。所以微血管内皮细胞可能足RIB的最丰要效应细胞。由此可见，寻找以脑微血管内皮细胞再生为治疗靶点的方法可能是治疗RIB的最有效手段。血管内皮牛长因子(vascularendothelialgrowthfactor，V

4、EGF)是一种最为有效的促血管生成因子，已有很多研究证实往缺血部位导入VEGF可以显著诱导血管新生。骨髓问充质干细胞(mesenchymalstemcells，MSC)是有多项分化潜能的成体干细胞，来源广泛，易于分离和培养，也是基因治疗的一种合适的工具细胞。基因联合细胞移植治疗已经在血管再生工程学上得到广泛应用。本研究的目的：构建VEGF基因重组腺病毒(为便于中山大学博{：学位论文VEGF基因修饰MSC移植促进放射性脑损伤后脑微血管新生的实验研究在后续实验中区别转基因VEGF和宿主内源性的VEGF，我们

5、在VEGF目的片断上添加一个HA标签)，转染MSC，植入放射后大鼠脑微血管损伤区，观察其分泌VEGF，是否可以促进该部位血管新生，改善脑功能。本实验内容分为三部分：1、Ad．VEGF．HA重组腺病毒的构建和鉴定；2、Ad．VEGF．HA重组腺病毒转染MSC和VEGF的表达及其分泌；3、VEGF联合MSC移植治疗促进放射性脑微血管内皮的新牛。第1章Ad。VEGF—HA重组腺病毒的构建和鉴定研究目的构建Ad—VEGF．HA重组腺病毒并进行鉴定。研究方法pcDNA3．0．VEGF．HA(质粒为山东大学张刚博士

6、馈赠)测序后行EcorI和KpnI双酶切回收，与用同样酶切回收的pAdtrack．CMV质粒连接为pAdtrack—CMV-VEGF—HA，连接质粒用PineJ『酶切，回收目的片断后与pAdeasy共转化大肠杆菌BJ5l83、DH5a，鉴定后用PacJ『酶切回收转染HEK293A细胞迸行包装。约10天后细胞病变比较完全和细胞内绿色荧光变弱时，回收、反复冻融HEK293A细胞，离心回收上清行酶切、电泳鉴定和病毒滴度测定。结果1．鉴定pAdtrack．CMV-VEGF·HA穿梭质粒、pAdeasy-CMV-

7、VEGF—HA整合质粒和重组腺病毒基因组内含VEGF．HA基因。2．HEK293A细胞内荧光显示病毒包装成功。病毒滴度约为T=I×i0¨GTU／mL。结论成功构建Ad．VEGF．HA重组腺病毒，为卜一步转染MSC做好准备。中山大学博士学位论文VEGF基冈修饰MsC移植促进放射性脑损伤后脑微血管新生的实验研究第2章Ad．VEGF．HA重组腺病毒转染MSC和VEGF的表达及其分泌研究目的将Ad．VEGF．HA重组腺病毒转染入MSC内，使MSC稳定表达并分泌VEGF。研究方法全骨髓法(直接培养法)获取SD大鼠

8、骨髓间充质干细胞。MSC传两代后将细胞接种于25cm2培养瓶中，培养至90％融合时进行转染。添加Ad．VEGF—HA重组腺病毒0．5ml(MOI=50)，转染3小时后更换培养液，48小时后观察转化效率。免疫组化和方法测定VEGF表达。ELISA法检测重组MSC细胞分泌的VEGF。结果1．Ad．VEGF．HA重组腺病毒感染MSC后6h(MOI=50)，部分细胞已经有荧光显示，随着转染时间的延长，荧光越来越强。转化率可达80％。2．抗HA免疫组