grin2b shrna的构建及其对小鼠nr2b基因沉默效果的实验研究

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1、中图分类号垦鱼!垒UDC610硕士学位论文学校代码!Q533密级公五GRIN2BshRNA的构建及其对小鼠NR2B基因沉默效果的实验研究ConstructionofGRIN2BshRNAanditsgenesilencingeffectsofNR2Binmouse作者姓名：学科专业：研究方向：学院(系、所)：指导教师：章饶香临床医学麻醉学湘雅三医院黄东教授答辩委员会中南大学2013年5月原创性声明哪Y帆2㈣42㈣4㈣94眦9帅本人声明，所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了论文中特另tlDn以标注和

2、致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中南大学或其他单位的学位或证书而使用过的材料。与我共同工作的同志对本研究所作的贡献均已在论文中作了明确的说明。作者签名：{垃日期：业年上月车日学位论文版权使用授权书本人了解中南大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留学位论文并根据国家或湖南省有关部门规定送交学位论文，允许学位论文被查阅和借阅；学校可以公布学位论文的全部或部分内容，可以采用复印、缩印或其它手段保存学位论文。同时授权中国科学技术信息研究所将本学位论文收录到《中国学位论文全文数据库》，并通过网络向

3、社会公众提供信息服务。作者签名：童童垂导师签名日期：业年上月卑日盈GRIN2BshRNA的构建及其对小鼠NR2B基因沉默效果的实验研究摘要：目的：1．设计并构建小鼠NMDA受体NR2B亚基短发卡RNA干扰真核表达载体(GRIN2BshRNA)并鉴定。2．通过鞘内转染聚乙烯亚胺(PEI)介导的GRIN2BshRNA干扰质粒，研究该干扰质粒对小鼠NR2B基因表达的影响，探讨GRIN2BshRNA干扰质粒用于慢性疼痛治疗的可行性。方法：1．根据NMDA受体NR2B亚基mRNA编码序列，设计并合成针对NR2B亚基的特异性RNA干涉片断，将其克隆入p

4、Yr-1．1质粒载体，构建NR2B亚基shRNA真核表达载体pYr-1．1-GRIN2B．shRNA，并对其进行酶切和测序鉴定。2．选用成年雄性C57BL／6小鼠60只，随机分为4组：正常组、生理盐水组、阴性对照组和PEI．shRNA组。于鞘内注射后第7天在小鼠足底皮下注射50uL1％的福尔马林后对其进行疼痛行为学观察，并且取小鼠腰段脊髓分别行RT-PCR、WestemBlot检测及免疫组化分析，观察小鼠脊髓NR2BmRNA、蛋白的表达水平及定位。结果：1．酶切和测序结果均证明NMDA受体NR2B亚基短发卡RNA已经插入到质粒载体pYr-1

5、．1里。2．疼痛行为学观察显示：福尔马林所致的I相期(急性期)的伤害性反应，在各组中均无差别(p>0．05)；与正常组、生理盐水(NS)组、阴性对照(Scr)组相比，PEI．shRNA组II相期(强直期)的伤害性反应显著减少(p<0．05)，而正常组、生理盐水组和阴性对照组比较，无显著性差异(p>0．05)。3．PCR及WestemBlot检测小鼠脊髓NR2BmRNA及蛋白的表达显示：与正常组、NS组和Scr组相比，PEI．shRNA组小鼠L4．6段脊髓的NR2BmRNA及蛋白表达水平明显降低(p

6、较，无显著性差异(p>0．05)。4．免疫组化结果显示：NR2B主要在小鼠L4．6段脊髓背角浅层表达；与正常组、NS组和Scr组相比，PEI．S11IⅢA组小鼠L4—6段脊髓NR2B阳性的细胞数明显减少(p<0．05)，而正常组、NS组和Scr组比较，无显著性差异(p>0．05)。结论：1．pYr-1．1-GRIN2B．shR_NA干扰质粒构建成功，为后续NR2B作为镇痛靶点的基因治疗奠定了基础。2．PEI介导的GRIN2BshRNA干扰质粒能够使小鼠脊髓NR2B的表达明显下调。3．PEI介导的GRIN2BshRNA干扰质粒能够减轻福尔马林

7、引起的工I相炎性痛，进一步证明NR2B在疼痛的维持与中枢敏化中起重要作用，为疼痛治疗提供了新的方法和思路。4．图8幅，表2个，参考文献34篇。关键词：NR2B；RNAi短发卡RNA；疼痛分类号：R614IIIConstructionofGRIN2BshRNAanditsgenesilencingeffectsofNI也BinmouseABS’I’RAC’I’：Objeetive：1．TodesignandconstructshorthairpinRNA(shRNA)eukaryoticexpressionplasmidstargetingt

8、hegeneofN·methyl-D—aspartate(NMDA)receptorNR2Bsubunit(GRiN2BshRNA)andidentified．2．Toinves