肿瘤细胞核酸适配体的筛选与序列优化及其应用研究

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1、万方数据学校代号：10532学号：B1011S0018密级：湖南大学博士学位论文肿瘤细胞核酸适配体的筛选与序列优化及其应用研究万方数据Selection，OptimizationandApplicationofAptamersforCancerCellbyTANYuyuB．S．(PutianUniversity)2008AdissertationsubmittedinpartialsatisfactionoftheRequirementsforthedegreeofDoctorofScienceAnalyticalChemistryintheGraduateSchoolofHunanUn

2、iversitySupervisorProfessorⅥ馅NGKeminDecember，2014万方数据湖南大学学位论文原创性声明本人郑重声明：所呈交的论文是本人在导师的指导下独立进行研究所取得的研究成果。除了文中特别加以标注引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体己经发表或撰写的成果作品。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均己在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律后果由本人承担。作者签名：耐雪日期：蒯年，2月分日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借

3、阅。本人授权湖南大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。本学位论文属于1、保密口，在年解密后适用本授权书。2、不保密吐(请在以上相应方框内打“、／’’)作者签名：谭掺寻别醛辄铂日期：)p

4、弛年／2-A8Et勿／多年，二月9日万方数据摘要发展具有高特异性和高灵敏度的分子识别探针对实现肿瘤的早期诊断、转移预警和疗效评估等具有非常重要意义。肿瘤细胞核酸适配体的出现为分子层面的肿瘤研究提供了理想的分子识别探针和新的发展机遇。目前，核酸适配体已在生物学、化学和医学等领域获得了长足的发展和应用，成为当前生物化学分析的研究重点

5、和热点。然而现有核酸适配体应用的靶标仍非常有限，严重限制了核酸适配体的广泛应用，另外，肿瘤细胞核酸适配体筛选方法存在步骤繁琐、筛选周期长等缺点，因此，建立和发展快速、高效的核酸适配体筛选技术和获取更多有效的肿瘤核酸适配体对核酸适配体研究具有非常重要的意义；同时，充分发挥核酸适配体应用方面的独特优势，将核酸适配体技术与物理、化学、材料科学等领域发展的新技术和新成果相结合，探索构建高灵敏的现代分析新技术、新方法，将为核酸适配体在现代生物分析化学和分子医学领域的发展研究产生巨大的推动作用。基于此，本论文围绕构建高效的细胞核酸适配体的筛选方法和技术平台，获取具有重要应用价值靶标分子的核酸适配体，

6、结合纳米技术和生物传感技术，将核酸适配体分子探针与肿瘤细胞的识别转换成可检测的信号，构建高特异性、高灵敏度的肿瘤细胞核酸适配体传感器。具体研究内容如下：一、人肝癌细胞株HepG2核酸适配体的筛选及应用基于cell．SELEX筛选技术，围绕影响筛选的因素、筛选的压力等关键问题，对文库的稳定性、筛选过程中的分离方法、缓冲液、离子强度、非特异性吸附、孵育的温度、洗脱的强度和温度等进行了系统的研究，优化了细胞核酸适配体筛选条件与流程。并以人源肝癌细胞株HepG2的核酸适配体筛选为模型，我们成功地建立和优化了细胞核酸适配体筛选方法，获得了高亲和力、高特异性识别人源肝癌细胞株HepG2的核酸适配体，

7、其平衡解离常数均在纳摩尔级，且具有良好的温度稳定性，有望用于核酸适配体传感器的构建和生物临床应用研究。二、基于单壁碳纳米管(SWCNT)吸附高效的核酸适配体筛选方法的建立及应用基于已经建立的细胞核酸适配体筛选平台，我们首次将SWCNT纳米材料引入细胞核酸适配体筛选过程中，利用SWCNT能够有效地吸附单链DNA的特性，改进传统筛选的简单使用洗脱缓冲液的洗涤方式，高效的去除筛选过程中未与靶标结合的单链DNA和弱结合的单链DNA。以人源鼻咽癌细胞株CNE2核酸适配体的筛选为模型，选择HONE细胞为对照细胞，仅通过6轮筛选，即获得了一组高亲和力、高特异性识别CNE2的核酸适配体，而未加入SWCN

8、T的传统筛选方法则需要通过15轮才能获得人源鼻咽癌细胞株CNE2核酸适配钵。表明SWCNTⅡ万方数据博士学位论文的加入明显地缩短了筛选周期，极大地提高了筛选效率，为核酸适配体的高效筛选提供了新的方法和技术平台。三、细胞核酸适配体的序列优化及应用研究基于本课题组获得的三种肿瘤细胞核酸适配体，利用核酸适配体二级结构分析法对其进行序列优化。用软件Mfold分别对鼻咽癌细胞株CNE2、肝癌细胞株SMMC．7721和胆管癌细胞株QBC．939