耐药卵巢癌细胞的体外筛选及核酸适配体的初步应用

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1、学校代码10530学号201510141375分类号X132密级公开硕士学位论文耐药卵巢癌细胞的体外筛选及核酸适配体的初步应用学位申请人何俊清指导教师李松青副教授、上官棣华研究员学院名称化学学院学科专业化学研究方向分析化学二零一八年五月二十八日InvitroselectionofaptamertotaxinolresletanecellsandbasicapplicationofaptamerCandidateJunqingHeSupervisorAssociateProfessor.QingsongLi，Prof

2、essor.DihuaShangguanCollegeCollegeofChemistryProgramChemistrySpecializationAnalyticalchemistryDegreeMasterofScienceUniversityXiangtanUniversityDateMay,2018摘要核酸适配体(aptamer)是通过体外筛选技术，即指数富集的配体系统进化技术(Systematicevolutionofligandsbyexponentialenrichment，SELEX)得到的单链D

3、NA或RNA。核酸适配体被称为“化学抗体”，有着与蛋白抗体相同的识别机制，并且，较蛋白抗体具有一定的优势：可直接通过化学合成并能根据要求对其修饰；亲和力高，结合解离常数甚至可达到纳摩尔级；结构稳定，便于保存等。利用活的肿瘤细胞为靶标的cell-SELEX技术，能够在靶标分子未知的前提下，筛选得到识别肿瘤细胞的核酸适配体，直接用于肿瘤的诊断及治疗。本论文利用cell-SELEX技术筛选靶向肿瘤细胞的核酸适配体，对核酸适配体进行结构分析和性质表征，并尝试利用这些核酸适配体开发肿瘤的诊断和治疗新方法，具体研究如下：耐药型

4、的卵巢癌细胞的筛选及表征：以紫杉醇耐受的卵巢癌细胞A2780T作为筛选的靶细胞，野生型卵巢癌细胞A2780作为反筛细胞，筛选出选择性识别A2780T细胞的核酸适配体HF3和HA5。对其进行序列优化及表征，得到具有高亲和力的核酸适配体HF3-58和HA5-68，进一步表征发现，二者对温度有很好的耐受力，二价离子对结合也没有影响，它们的靶分子可能是细胞膜上不同的糖蛋白。利用核酸适配体HA5-68和HF3-58可发展新型分子探针，用于诊断卵巢癌耐药性。耐药型卵巢癌细胞核酸适配体的应用初探：利用cell-SELEX技术筛选

5、得到的核酸适配体在其靶分子未知的情况下，要使筛选出的核酸适配体有应用前景，需要考察其各方面的性能特征，例如在人血清、模拟实际人血浆中是否会被降解；温度对核酸适配体与人血清内靶细胞结合的影响；核酸适配体对细胞的毒性等。通过一系列的实验显示，核酸适配体HF3-58和HA5-68能在人血清加肝素或者是螯合(EDTA)时稳定存在，两者几乎无细胞毒性等，暗示核酸适配体HF3-58和HA5-68有着比较好的生物应用前景。核酸适配体靶向载药的相关应用：核酸适配体纳米火车结构，是通过延长核酸适配体末端双链结构中的一条链，使核酸适配

6、体甩出一条短的单链，此单链外加两条茎环结构的短链，能够触发杂交链式反应，形成长的DNA双链结构，继而负载大量的能够结构结合DNA双链的药物阿霉素，而核酸适配体的特异性识别作用能够有效的靶向目标细胞，减少对正常细胞的杀伤。核酸适配体HG1-7的靶分子是转铁蛋白受体，而转铁蛋白受体在癌细胞表面大量表达，但在正常细胞中的表达很低。利用此核酸适配体构建负载阿霉素的长链DNA分子，能够有效I的靶向并进入肿瘤细胞，然后释放出阿霉素杀伤肿瘤细胞。关键字：核酸适配体，筛选，人血清，纳米火车IIAbstractAptamerissi

7、nglestrandDNAorRNAsequenceselectedbySELEX(Systematicevolutionofligandsbyexponentialenrichmenttechnology).Aptamerisalsonamedchemicalantibodyforitssamerecognizemechanismasproteinantibody.Andaptamerhassomeadvantagesoverproteinantibody:couldbechemicalsynthesizeddi

8、rectlyandmodifiedbyorder;hashighaffinitytotargetwithnanomolardissociationconstant;hasstablestructureandeasytopreserve.Cell-SELEXuseinvivotumorcellastargettoselectaptamer,whichcould