体外selex技术筛选spa适配子的研究及初步应用

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1、第二军医大学博士学位论文体外SELEX技术筛选SpA适配子的研究及初步应用姓名：马立强申请学位级别：博士专业：临床检验诊断学指导教师：兰小鹏201205体外SELEX技术筛选SpA适配子的研究及初步应用中文摘要【目的】SpA是金黄色葡萄球菌的重要毒力因子，它在金葡菌抗吞噬细胞吞噬、诱导分泌天然抗体的B细胞凋亡、引起葡萄菌性肺炎、心内膜炎等方面发挥重要作用。本研究旨在利用指数富集配基的系统进化(SELEX)技术，以磁珠结合的SpA作为靶分子，从体外合成的96个nt的随机寡核苷酸文库中筛选出与SpA高亲和力、高特异性结合的适配子：并建立生物素标

2、记适配子SpA的ELISA的检测方法；寻找抑$0SpA功能位点适配子，达到控制金黄色葡萄球菌毒力的效果。【方法】1．将SpA包被于Dynal磁珠，并用BCA法检测SpA的包被效率，用免疫吸附法检测SpA包被磁珠后结构是否改变。2．在体外构建两端为固定序列、中间为60个nt的随机序列、全长96个nt的寡核苷酸文库，以磁珠包被的SpA为靶标，以磁力架分离结合与未结合的ssDNA，通过不断增加筛选的强度(增力HtRNA量、缩短结合时间、增加震荡频率等)，经SELEX筛选，筛选与SpA高亲和力、高特异性结合的适配子。3．反筛：在第7轮、第9轮和第1

3、2轮筛选前，用ssDNA文库与空白磁珠结合，以未与空白磁珠结合的ssDNA文库做为筛选库，与SpA包被磁珠结合，以除去与SpA非特异性结合的ssDNA。4．用荧光集团标记ssDNA作为筛选文库，应用TBS--380荧光定量仪测定2、4、6、7、9、10、1l、12轮总投入库与未与SpA结合的ssDNA的荧光值，计算出各轮总投入库和筛选后与SpA结合的ssDNA量，观察ssDNA的富集情况。5．将最后一轮筛选产物分别进行扩增、纯化、TA克隆、“蓝一白"斑选择、测序，得到适配子的核酸序列，并用相关软件分析适配子的一级和二级结构，了解适配子的各结

4、构特点并根据序列相似性和自由能挑选适配子家族。6．用Dot-blot方法测定适配子家族与SpA的结合情况。7．生物素标记适配子，根据SpA-适配子一生物素一亲合素一碱性磷酸酶一底物结合反应步骤，用适配子ELISA方法测定不同浓度适配子与SpA的结合情况，并用GraphPadPrism软件通过非线性回归分析获得适配子的解离常数。8．将适配子标记胶体金颗粒，将靶物质点样于硝酸纤维素膜，用斑点免疫金渗滤法分析适配子与SpA结合的特异性。第二军医大学博士学位论文9．建立适配子ELISA检N{ISpA方法，并建立标准曲线。10．建立SpA结合的磁珠I

5、gG吸附方法，观察适配子对SpA与IgG结合的抑制。11．从细胞学角度，根据细菌或SpA刺激细胞产生的IL-8和P38磷酸化特性，观察适配子对金黄色葡萄球菌和SpA的抑制情况。12．用小鼠做体内实验，观察适配子作用下，金黄色葡萄球菌感染小鼠肺炎、菌血症、死亡等事件发生情况，观察金黄色葡萄球菌感染或SpA作用小鼠，肺内白细胞的募集情况。【结果】1．SpA高效率包被磁珠，包被效率为88．18％；并且包被后不影响SpA与IgG结合。2．随着筛选轮数的增加，ssDNA富集库与SpA结合的荧光值逐渐增加，第十二轮筛选获得的富集库与SpA结合率45．6

6、％是第一轮2．1％的21．7倍。到第九轮，ssDNA富集库与SpA的结合达到基本饱和状态时，吸附至USpA上的ssDNA不再增加。3．48个克隆序列结果显示，共有45个菌落得到结果，根据软件分析，所有序列二级结构都以茎环、发夹结构为主，根据序列和结构，共挑选出五个家族做进一步分析。各家族间同源性大都在70％以下。4．经Dot-blot方法检测发现，第一、第二、第三适配子家族与SpA结合的阳性结果最强。进行亲和力测定，四个家族的Kd值分别为：17．31士6．24nM：25．22士7．5lnM、24．27士6．98nM、53．18士7．58nM

7、；通过胶体金渗滤法检测发现第一、第二、第三家族均与SpA特异性结合。5．通过用生物素标记适配子，建立了第二家族适配子ELISA方法，并建立了SpA做定量检测标准曲线。6．通过免疫吸附抑制实验发现，第一家庭适配子可以明显抑SUIgG与SpA的结合，使SpA结合IgG的比例从35．0％降至10．7％。7．金黄色葡萄球菌或SpA与表皮细胞TNFR作用促进P38磷酸化，并最终导致细胞IL一8分泌增加，加入第一家族适配子后，细菌作用下细胞IL一8浓度从971．67±359．40pg／ml减少至U487．08±189．09pg／ml(P=0．0013)

8、，SpA作用下细胞IL一8浓度从778．08±278．52pg／ml减少至U255．58±136．76pg／ml(P<0．0001)。表皮细胞P38磷酸化增加。8．小鼠金黄色葡萄