selex技术筛选青霉素类抗生素适体及其运用方法的初步探索

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1、捅璺SELEX技术筛选青霉素类抗生素适体及其运用方法的初步探索预防兽医学专业硕士研究生：秦川指导老师：田晋红副教授摘要青霉素类抗生素(Penicillin．a11tibiotic)是一类高效的抗革兰氏阳性菌药物。由于频繁地以超剂量使用，造成其在动物源性食品中的残留，严重影响人们身体健康和进出口贸易。因此开发快速、准确、经济的检测青霉素类抗生素残留的方法在生产和生活中具有重要意义。目前对青霉素类抗生素残留的检测方法主要有微生物法、仪器分析法、免疫试剂盒法等，上述方法已经广泛地用于日常检测的各个方面，

2、在运用中各有其优缺点：微生物法经济实用，但耗时长，特异性和灵敏度差；仪器分析法特异性好、灵敏度高，但步骤烦琐，且需要采用昂贵的设备；免疫试剂盒法具有检测速度快、特异性好等特点，但其价格比较贵。本研究主要通过指数富集的配体系统进化(SELEX)技术从庞大的核酸文库(容量为3×1014)中筛选获得与靶分子6．氨基青霉烷酸(6．APA)具有高特异性亲和的寡核苷酸适体(apt锄er)，并对其运用方法进行初步探索，为核酸适体检测青霉素类抗生素残留奠定基础。全文分为两个部分：一、运用含35个随机序列，全长为7

3、8nt的ssDNA作为筛选文库，采用Epoxy活化琼脂糖凝胶FF作为固相分离介质偶联6．触'A。通过SELEX技术用核酸文库与配体相亲和，经缓冲液洗脱，将吸附在配体上的核酸用PCR进行扩增，保留扩增产物，作为下一轮亲和的文库，如此反复。其中，每3轮进行一次反筛，选用甘氨酸Gly偶联在Epoxy活化琼脂糖凝胶FF作为反筛物，以除去和琼脂糖凝胶特异性亲和的ssDNA。在筛选过程中，逐步提高洗脱液的洗脱强度，经过25轮SELEX循环筛选获得能与6．APA特异性亲和的寡核苷酸适体。将最后一轮的PCR产物和

4、T载体相连接，通过转化到感受态细胞中进行克隆，随机挑选12个白色菌落，经菌落直接PCR得到10个阳性克隆。测序后成功得到9个DNA序列，对其一、二级结构进行分析，通过DNASYSV2．5软件分析二级结构的差异，根据序列的差异将适体初步分成A、B、C、D、E五组。二、以筛选出的核酸适体序列为基础，结合PCR技术，将p．内酰胺类抗生素——氨苄西林(AMP)、阿莫西林(AMO)和头孢曲松(CeRria)【one)——偶联两南大学硕十学何论文到Epoxy活化琼脂糖凝胶FF上进行检测，初步确定青霉素类抗生素

5、的最佳适体为D组ssDNA；然后，将一定浓度的6．APA偶联到Epoxy活化琼脂糖凝胶FF上，用甘氨酸封闭，通过D组适体进行亲和，接合PCR技术，初步测定该方法的检测范围可达到2．5“g／l(g；最后，通过核酸适体结合PCR检测法对鸡肉组织中的青霉素类抗生素残留进行检测，并用传统的微生物法对其回收率进行检测，初步证明了适体在抗生素残留检测方面的可操作性。关键词：指数富集配体系统进化技术适体6．氨基青霉烷酸青霉素类抗生素IIAbstractScreeningofamnityDNAthepenicil

6、lin—a五tibioticprenmlnaryeXplOratlOnO士Candidate：QinChuanSupervisor：TianJinhongAbstractThepenicillinantibioticisakindofhighlyefrectivemedicineofaIlti-Graln-positiVebact甜a．BecauSetheyareused能quentlybyultradosage，itmal(esresiduesina11imalsourcefood，aIldha

7、zardshealthofthepeopleandt1硷impon．expontradeseriously．nissi盟ificanttodevelopmepenicillina11tibioticdete姗inationwhichisinstallt—View，accllrate，economicintbeproductionandthelife．Currently，merearcanumberofmajormethodsoft11emicroo唱a血sm，a11alysisbyinstnlll

8、l铋t，andthekitofi删munosorbentaSsay，w11ichhavebecllusedindailyinspectjonandhaVeadValltagesa11ddjsadVaIltages．Themicrooragarlism．assayiseconomicand印plicable，buttimecons啪ing，asweU淞，theSpecificityaIldthesensitiVityarepoor．Theinstmment—aSsayishiglls