《北疆地区猪繁殖与呼吸综合征病毒分子流行病学调查及病毒全基因组序列分析.pdf》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。
分类号：密级：学号：2015201704单位代码：10759石河子大学硕士学位论文北疆地区猪繁殖与呼吸综合征病毒分子流行病学调查及病毒全基因组序列分析学位申请人张勋盛金良（副教授）指导教师王衡（副教授）申请学位门类级别农学硕士专业名称基础兽医学研究方向动物疾病分子生物学所在学院动物科技学院中国·新疆·石河子2018年6月 分类号：密级：学号：2015201704单位代码：10759石河子大学硕士学位论文北疆地区猪繁殖与呼吸综合征病毒分子流行病学调查及病毒全基因组序列分析学位申请人张勋盛金良（副教授）指导教师王衡（副教授）申请学位门类级别农学硕士专业名称基础兽医学研究方向动物疾病分子生物学所在学院动物科技学院中国·新疆·石河子2018年6月 Molecularepidemiologysurvey,geneticmutationanalysisofcompletegenomesequencesofporcinereproductiveandrespiratorysyndromevirusinthenorthernXinjiangADissertationSubmittedtoShiheziUniversityInFulfillmentoftheRequirementsfortheDegreeofMasterofAgricultureByZhangXun(BasicVeterinaryMedicine)DissertationSupervisor:AssociateProf.ShengJin-liangandWangHengJune,2018 石河子大学学位论文独创性声明及使用授权声明学位论文独创性声明本人所呈交的学位论文是在我导师的指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含其他个人已经发表或撰写过的研究成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中作了明确的说明并表示谢意。研究生签名：时间：年月日学位论文版权授权书本人完全了解石河子大学有关保留、使用学位论文的规定，学校有权保留学位论文并向国家主管部门或指定机构送交论文的电子版和纸质版。有权将学位论文用于赢利目的的少量复制并允许论文进入学校图书馆被查阅。有权将学位论文的内容编入有关数据进行检索。有权将学位论文的标题和摘要汇编出版。保密的学位论文在解密后适用本规定。研究生签名：时间：年月日导师签名：时间：年月日 中文摘要猪繁殖与呼吸综合征(Porcinereproductiveandrespiratorysyndrome,PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSvirus,PRRSV)引起的一种严重危害全球猪业生产的高度传染病。目前，我国呈现欧洲型和美洲型PRRSV毒株稳定共存，经典毒株、高致病毒株和NADC30-like毒株混合感染的情形，同时PRRSV的易变异和高频率基因重组等特性，共同导致我国PRRS的流行状况尤为复杂。为了解本地区PRRSV遗传变异和分子流行病学情况，从发病猪场采集疑似PRRS病料，通过保守基因ORF7引物进行检测，使用RT-PCR方法扩增病毒nsp2部分基因和ORF5基因进行测序，选取国内外代表毒株进行核苷酸和氨基酸序列对比，采用最大似然法进行系统进化分析。结果显示100份样品中，33份为PRRSV阳性，阳性率为33%；随机抽取的13份阳性病料，使用RT-PCR方法获得8段nsp2部分基因和12段ORF5基因，序列比对和系统进化分析显示，13份样品中，除1株为经典毒株变异株，2株为疫苗毒株，其余均为高致病毒株，虽未检测到NADC30-like毒株存在，但在GP5蛋白分析中发现本试验部分毒株具有NADC30-like毒株部分变异特征。鉴于新疆地区PRRSV毒株较为复杂，为更加准确的掌握本地区PRRSV毒株特征。使用Marc-145和PAM细胞对经典毒株变异株PRRSVXJzx1进行分离，参考HK13毒株设计9对特异性引物，进行全基因组测序，选取国内外代表毒株进行序列一致性比对，构建最大似然法系统进化树进行分析。结果显示，XJzx1株是目前国内外发现的突变频率较高的美洲型毒株，为NA2型美洲型毒株，与HB-2(sh)/2002、QYYZ和HK13遗传进化关系较近；基因重组分析显示，XJzx1为BJ-4和QYYZ重组毒株。鉴于新疆地区PRRSV的感染较为普遍的特点，为建立北疆地区PRRSVRT-PCR鉴别诊断方法，利用本研究中获得的nsp2基因序列，设计特异性PRRSV引物，建立其RT-PCR鉴别诊断方法。结果显示建立的RT-PCR方法对经典/高致病毒株扩增长度分别为484bp/394bp，可较为明显的区分PRRSV致病性，对其他猪常见传染病原均无特异性扩增，且检测灵敏度高，最低检测量为30个拷贝。100份临床样本检测显示，33份为PRRSV阳性，其中经典/高致病分别为6份/27例。表明该方法适合于本地区PRRSV临床诊断及PRRSV病原普查等工作。综上，目前北疆地区呈现高致病毒株不断蔓延的趋势，同时经典毒株不断变异和重组，导致新型毒株层次不断；虽然尚未发现NADC30-like毒株存在，但PRRS防控形势依然严峻。根据临床检测表明，基于本试验所得数据所建立的PRRSVRT-PCR鉴别诊断方法，能较好的进行本地区PRRSV区分诊断。本研究摸清了北疆地区PRRSV流行状况和遗传变异特点，并建立了适用于本地区的PRRSVRT-PCR方法，对新疆地区PRRS的预防、控制具有重要意义。关键词：猪繁殖与呼吸综合征病毒；遗传变异；全基因分析；RT-PCRI AbstractPorcinereproductiveandrespiratorysyndrome(PRRS)isoneofthemosthighlyinfectiousdiseasesinpigindustry,whichcausedbyporcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus(PRRSV).Inrecentyears,theepidemicshowthestablecoexistenceofdifferentgenotypesstrainsconsistedbyEuropean(Type1)andNorthAmerican(Type2)inChina.Inaddition,themixedinfectionofclassical-PRRSV(C-PRRSV)strain,highlypathogenic-PRRSV(HP-PRRSV)strainandNADC30-likestrainareexistent.Morever,thefeaturesofmutabilityandhigh-frequencygenerecombinationofPRRSVhavecausedmoreserioussituationinChina.TogainpreliminaryunderstandingofthemolecularepidemiologyofPRRSVinXinjiang,wecollectedsuspectedsamplesfromPRRSinfectedpigfarmsinnorthernXinjianganddetectedthembyidentifyingPCRprimers.Then,thensp2particalgeneandORF5genewereamplifiedbyRT-PCRfromparticalPRRS-positivesamples.RepresentativePRRSVisolationscollectedfromhomeandabroadwereusedfornucleotideandaminoacidsequencecomparisontonativePRRSVstrainsforgeneticmutation,andthemaximumlikelihoodmethodwasalsointroducedforphylogeneticanalysis.Theresultsshowedthat33ofthe100sampleswerePRRSV-positive.13positivesampleswererandomlyselected,and8segmentsofnsp2geneand12segmentsofORF5genewereobtainedbyRT-PCR.Theresultshowedthat:(1)onestrainwasC-PRRSV.(2)twostrainswerevaccine.(3)therestwereHP-PRRSV.EventhoughtherewerenoNADC30-likestrain,somestrainshaveNADC30featuresthroughtheanalysisofGP5protein.InordertograspthecharacteristicsofPRRSVstrainsmoreaccuratelyinthisregion,thePRRSVXJzx1strainwasisolatedbyMarc-145/PAMcellandthewholegenomesequencingwasalsolaunched.RepresentativePRRSVstrainswerecollectedfromhomeandabroadusedfornucleotideandaminoacidsequencecomparison,themaximumlikelihoodmethodalsointroducedforphylogeneticanalysisaswell.TheresultsshowedthattheXJzx1strainwasthemostfrequentlymutatedstrainintheworld,andthisisolatebelongtoNA2-PPRRSV.IthascloselyrelationshipwithHB-2(sh)/2002,QYYZandHK13isolations.ThegenerecombinationillustratedthatXJzx1recombinedbyBJ-4andQYYZisolates.Finally,inconsiderationofcomplexinfectionsituationofPRRSVinXinjiang,thisresearchusedthensp2genedatawhichobtainedinforemoststudytodesignspecificprimersforestablishingasuitablylocalPRRSVRT-PCRmethod.TheresultsshowedtheestablishedRT-PCRmethodfortheamplificationlengthofclassical-/highlypathogenicstrainwere484bpand394bp.ThismethodcanbeeasilydistinguishandidentifythepathogenicityofPRRSV,whileexistingnospecificamplificationofothercommoninfectiouspathogens.Theminimumdetectionamountis25copies.100casesclinicalsamplestestshowedthat33werePRRSVpositive,including6casesofC-PRRSVand27casesofHP-PRRSV.AccordingtothemolecularepidemiologysurveyandgeneticmutationanalysisofgenomesequencesofPRRSV,theC-PRRSVhasbeensufferinghigh-frequencymutationandgenerecombination,meanwhile,HP-PRRSVstrainhasbeenspreadinginthemostplaceofnorthernXinjiang.EventhoughwehadnotfoundNADC30-likestrain,theserioussituationinthisregionposeathreattotheII preventionandcontrolofPRRSV.Inaddition,theclinicaltestsdemonstratedthatthePRRSVRT-PCRmethodestablishedbyourselfcandiagnosethedifferentpathogenicityofPRRSV.Inconclusion,thisstudyhaselucidatedthedistributionandgeneticevolutionofPRRSVinXinjiang,andestablishedaPRRSVlocalRT-PCRmethod,whichisimportantforthepreventionandcontrolofPRRS.Keywords:Porcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus;geneticmutation；full-lengthgenomeanalysis；RT-PCR；III 目录中文摘要.....................................................................................................................................IAbstract......................................................................................................................................II目录.....................................................................................................................................III英文缩略词表..........................................................................................................................VI第一章文献综述.......................................................................................................................11.1历史回顾......................................................................................................................11.2PRRSV病原学研究.....................................................................................................11.2.1分类...................................................................................................................11.2.2分型...................................................................................................................11.2生长特性及形态结构..................................................................................................21.3PRRSV基因组特征.....................................................................................................21.1.3非编码区...........................................................................................................31.3.2非结构蛋白.......................................................................................................31.3.3结构蛋白............................................................................................................41.4PRRSV基因组的复制和转录......................................................................................61.5PRRSV致病机制.........................................................................................................61.6PRRSV免疫学.............................................................................................................71.6.1PRRSV对先天性免疫系统影响....................................................................71.6.2PRRSV对体液免疫影响..................................................................................71.6.3PRRSV对细胞免疫影响..................................................................................81.7PRRSV流行趋势.........................................................................................................81.8遗传变异及基因重组..................................................................................................91.8.1遗传变异...........................................................................................................91.8.2基因重组.........................................................................................................101.9PRRSV的检测与诊断技术.......................................................................................102.1本研究的目的和意义................................................................................................11第二章试验部分...................................................................................................................13试验一北疆地区PRRSVnsp2和GP5基因遗传变异分析................................................131材料与方法...........................................................................................................................141.1材料............................................................................................................................141.2方法............................................................................................................................141.2.1引物的设计与合成.........................................................................................141.2.2RNA的提取及RT-PCR..................................................................................15III 1.2.3目的基因的克隆、序列测定和分析.............................................................152结果与分析...........................................................................................................................172.1RT-PCR检测PRRSV.................................................................................................172.2部分PRRSV样品RT-PCR扩增结果......................................................................172.3部分PRRSV样品病毒序列测定..............................................................................172.3nsp2基因变异特征....................................................................................................182.3.1nsp2序列分析.................................................................................................182.3.2nsp2系统发育树分析.....................................................................................192.4GP5基因变异特征.....................................................................................................212.4.1GP5序列一致性分析......................................................................................212.4.2GP5氨基酸变异分析......................................................................................212.4.3GP5系统发育树分析......................................................................................242.4.4GP5蛋白功能变化分析..................................................................................263讨论.......................................................................................................................................263.1PRRSVXJzx1毒株遗传特性及致病性分析............................................................273.2PRRSVXJzx2和XJzx12毒株遗传特性及致病性分析..........................................273.2PRRSVXJzx3、XJzx5～11、XJzx13毒株遗传特性及致病性分析......................283.3总结............................................................................................................................28试验二PRRSV新疆变异株XJzx1的分离及全基因序列分析...........................................291材料与方法.........................................................................................................................301.1材料......................................................................................................................301.2试验动物及细胞........................................................................................................301.3方法..........................................................................................................................311.3.1引物设计.....................................................................................................311.3.2病毒分离.........................................................................................................311.3.3RNA的提取及RT-PCR...........................................................................321.3.4分离病毒的RT-PCR鉴定.............................................................................321.3.5全基因序列扩增.............................................................................................321.3.6目的基因的克隆和序列测定.......................................................................331.3.7全基因序列分析..............................................................................................332结果与分析.........................................................................................................................352.1病毒的分离.................................................................................................................352.2XJzx1株全基因分析.................................................................................................352.2.1全基因拼接结果.............................................................................................352.2.2Genbank序列比对..........................................................................................352.2.3核苷酸序列一致性及系统进化分析.............................................................36IV 2.2.3氨基酸序列一致性及系统进化分析.............................................................382.3XJzx1株基因重组分析.............................................................................................413.1PRRSVXJzx1一致性比对分析................................................................................423.2PRRSVXJzx1重组分析............................................................................................423.3总结............................................................................................................................42试验三北疆地区高致病性与经典PRRSVRT-PCR鉴别诊断方法的建立与应用............431材料与方法.........................................................................................................................441.1材料..................................................................................................................441.2方法............................................................................................................................451.2.1引物的合成.....................................................................................................451.2.2样品总RNA的提取......................................................................................451.2.3cDNA模板的制备..........................................................................................451.2.4PCR反应条件优化.........................................................................................451.2.5重组质粒的构建及测序.................................................................................461.2.6敏感性试验.....................................................................................................461.2.7特异性试验...................................................................................................461.2.8一致性检测...................................................................................................462结果与分析.........................................................................................................................462.1PCR反应条件的优化结果.....................................................................................462.2PCR产物的测序鉴定.............................................................................................462.3敏感性试验..............................................................................................................472.4特异性试验..............................................................................................................472.5临床病料检测结果..................................................................................................483讨论.................................................................................................................................49第三章试验结论.....................................................................................................................50参考文献...................................................................................................................................51致谢.........................................................................................................................................58V 英文缩略词表缩写词英文全称中文全称PRRSPorcinereproductiveandrespiratorysyndrome猪繁殖与呼吸综合征HighlypathogenicPorcinereproductiveandrespiratoryHP-PRRS高致病猪繁殖与呼吸综合征syndromePRRSVPorcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus猪繁殖与呼吸综合征病毒ClassicalPorcinereproductiveandrespiratoryC-PRRSV经典PRRSVsyndromevirusHP-PRRSVHighlypathogenicPorcinereproductiveandrespiratory高致病PRRSVsyndromevirusNorthAmericanPorcinereproductiveandrespiratoryNA-PRRSV美洲型PRRSV毒株syndromevirusEuropeanPorcinereproductiveandrespiratoryEU-PRRSV欧洲型PRRSV毒株syndromevirusPAMPorcinealveolarmacrophage肺泡巨噬细胞ADEantibodydependentenhancement抗体依赖性增强作用AAAminoacid氨基酸UTRUntranslatedregion非编码序列ORFopenregionframe开放阅读框gRNAgenomicRNA基因组RNAsgRNAsubgenomicRNAs亚基因组RNARdRpRNA-dependentRNApolymeraseRNA依赖性RNA聚合酶nspnonstructuralproteins非结构蛋白RTCreplication/transcriptioncomplex多聚复制转录酶复合体PRFprogrammedribosomalframeshift程序性核糖体移码PLPpapain-likecysteineproteinases木瓜样蛋白酶SPserineproteinase丝氨酸蛋白酶IFNinterferon干扰素PNEprimaryneutralizingepitope中和表位Decoydecoyepitope诱骗表位RCreplicationcomplexes复制复合体VI NKnaturalkillercell自然杀伤细胞CTLcytotoxiclymphocyteT淋巴细胞IFNInterferon干扰素PRVporcinepseudorabiesvirus猪伪狂犬病病毒MhMycoplasmahyopneumoniae猪肺炎支原体PCV2porcinecircovirustype2猪圆环病毒2型AmpAmpicillin氨苄青霉素PBSphosphatebufferedsaline磷酸缓冲盐溶液RT-PCRReversetranscriptpolymerasechainreaction逆转录聚合酶链式反应LBLuria-BertanimediumLB培养基MMoleperliter摩尔/升mMmillimoleperliter毫摩尔/升μMMicromoleperliter微摩尔/升PCRpolyacrylamideelectrophorisis聚合酶链式反应r/minRibonucleicacid转/分钟mRNAMessengerRibonuclease信使核糖核酸VII 北疆地区猪繁殖与呼吸综合征病毒分子流行病学调查及病毒全基因组分析第一章文献综述1.1历史回顾猪繁殖与呼吸综合征(Porcinereproductiveandrespiratorysyndrome,PRRS)，又称“蓝耳病”，是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSvirus,PRRSV)引起的一种以仔猪和育肥猪呼吸系统疾病，母猪繁殖障碍为特征的严重危害养猪业的高度传染病[1]。1987年在美地区PRRS被Keffaber首次报道[2]，我国于1996年分离出经典PRRSV毒株[3-4]。2006年我国南方省份爆发了由高致病猪繁殖与呼吸综合征病毒(HighlyPathogenicPRRSV,HP-PRRSV)导致的猪高致病猪繁殖与呼吸综合征(HighlyPathogenicPRRS,HP-PRRS)，并迅速自南向北蔓延至我国十几个省份，感染超过200万头猪。2008年，PRRSVNADC30毒株在美国分离[5]，2012年周峰报道我国存在PRRSVNADC30-like毒株[6]，随后快速蔓延于我国大部分地区，经鉴定在我国流行的PRRSVNADC-30like毒株为高致病型[7]。鉴于HP-PRRSV造成的巨大的经济损失，我国将HP-PRRS调整为一类动物传染病[8]，而C-PRRS为我国二类动物传染病。1.2PRRSV病原学研究1.2.1分类PRRSV属套式病毒目，动脉炎病毒科，动脉炎病毒属，该属还有鼠乳酸脱氢酶增高症病毒、猴出血热病毒和马动脉炎病毒其他三个成员[9]。1.2.2分型PRRSV目前只有一个血清型，根据抗原差异，可将PRRSV分为欧洲型(EU-PRRSV)和美洲型(NA-PRRSV)，代表毒株分别为LV株、VR-2332株，两型毒株至少存在40%的核酸序列差异，但在疾病表型、临床症状、基因组结构、发现的时间方面较为相似，这应该是由于两者起源相同，但在不同的大陆独立进化导致的[10-11]。EU-PRRSV型主要流行于欧洲国家，NA-PRRSV型主要流行于美洲及亚太地区，我国主要以美洲型为主，欧洲型为次的发展趋势。NA-PRRSV主要分为４个亚型，包括：(1)美洲Ⅰ型(NA1)，代表毒株为美国分离株VR-2332，在我国的代表毒株为BJ-4；(2)美洲Ⅱ型(NA2)，代表毒株为美国分离株JA-142，在我国的代表毒株为CH-1a；(3)美洲Ⅲ型(NA3)，代表毒株为分离株MN184B和NADC30，在我国的代表毒株为HENAN-XINX和JL580；(4)美洲Ⅳ型(NA4)，代表1 北疆地区猪繁殖与呼吸综合征病毒分子流行病学调查及病毒全基因组分析毒株为我国分离株JXA1和HuN4[12]。在我国NA1/NA2型均为经典PRRSV(ClassicalPRRSV,C-PRRSV)，NA3/4型均为高致病毒株，为便于论述，NA3称为HP-PRRSV毒株，NA4型称为NADC30-like毒株。EU-PRRSV主要分为３个亚型，包括：(1)欧洲Ｉ型(EU1)，代表毒株为荷兰分离株LV，在我国代表毒株为BJEU06-1；(2)欧洲Ⅱ型(EU2)，代表毒株为立陶宛分离的毒株Eigir；(3)欧洲Ⅲ型(EU3)，代表毒株为白俄罗斯分离的毒株Lena。EU-PRRSV毒力较弱，其中仅Lena毒株可导致发病猪的死亡[13-14]。1.2生长特性及形态结构PRRSV体内体外条件下都有严格的细胞嗜性[15]。PRRSV在体内，优先感染猪肺巨泡细胞(PorcineAlveolarMacrophage,PAM)；在体外，能够在原代PAM以及Marc-145、MA-104、CL2621等传代细胞系上繁殖[10,16]。PRRSV具有抗体依赖性增强作用(antibodydependentenhancement,ADE)，低浓度的抗体能显著加强PRRSV复制和感染，在较低滴度中和抗体存在的条件，病毒可以与抗体结合形成复合物，通过抗体的Fc片段与靶细胞的Fc受体结合,有助于病毒进入细胞。研究表明，在PAM的PRRSV培养物中加入一定滴度的PRRSV抗体，能显著促进病毒的含量。PRRSV为有囊膜的单股正链RNA病毒，电镜下呈现球形，直径大小约50~65nm，核衣壳内含有病毒核酸，为直径约25~30nm的呈丝状螺旋结构[17-18]。1.3PRRSV基因组特征PRRSV基因全长约14.9~15.5kb，有5’末端帽子和3’末端Ploy(A)尾结构，5’/3’端均有一段非编码序列(Untranslatedregion，UTR)，病毒包括至少10个大量重叠的开放阅读框(openregionframe,ORF)，依次为ORF1a、ORF1b、ORF2a、ORF2b、ORF3~ORF5a、ORF5b~ORF7(图1-1)[19-20]。PRRSV通过两种截然不同的转录机制表达非结构蛋白和结构蛋白，非结构蛋白可通过病毒基因组直接表达出来，而结构蛋白则通过亚基因组(subgenomicRNAs,sgRNA)翻译而来(图1-1)[21]。2 北疆地区猪繁殖与呼吸综合征病毒分子流行病学调查及病毒全基因组分析图1-1PRRSV基因组的结构、转录和翻译Fig.1-1Organization,transcriptionandtranslationofPRRSVgenome1.1.3非编码区PRRSV5’UTR和3’UTR与病毒的复制及翻译功能有着密切的关系，但是更加详细的功能和机理仍有待探究。EU-PRRSV和NA-PRRSV5’UTR差异较大，核苷酸同源性约50%，长度分别为217~222nt、188~191nt，但在同型毒株间的相对保守，同源性约为96%，目前已知功能包括：调节病毒基因组复制、转录和mRNA翻译[22-23]。3’UTR位于ORF7下游，Ploy(A)尾上游，EU-PRRSV和NA-PRRSV毒株3’UTR核苷酸同源性约70%，长度分别为110~114nt、150~151nt，但在同型毒株间的核苷酸同源性约为96%，其末端有一个高度保守的“CGUAAU”区域，可能与RNA依赖性RNA聚合酶(RNA-dependentRNApolymerase,RdRp)结合和病毒复制有关[24]。1.3.2非结构蛋白PRRSV基因组5'UTR下游有大量重叠的ORF，分为ORF1a、ORF1b，约占全基因组的80%，可直接利用自身基因组翻译病毒复制及转录相关的非结构蛋白(nonstructuralproteins,nsp)，包括多聚复制转录酶复合体(replication/transcriptioncomplex,RTC)、RdRp等。以VR-2332(U87392)序列作参考，ORF1最初编码4个大的多聚蛋白pp1ab(3960aa)、pp1a(2503aa)、ppla-nsp2TF(1403aa)和ppla-nsp2N(1234aa)，依靠2个程序性核糖体移3 北疆地区猪繁殖与呼吸综合征病毒分子流行病学调查及病毒全基因组分析码(programmedribosomalframeshift,PRF)机制[25]和4个蛋白酶最终产生至少16个非结构蛋白(nonstructuralprotein,nsp)，包括nsp1α/1β、nsp2~nsp6、nsp7/7β、nsp8~nsp12[26]。ORF1a编码pp1a，包括nsp1~nsp8，ORF1ab编码pp1ab，包括nsp1α/β、nsp2~6、nsp7/7β、nsp8~nsp12。ORF1a/ORF1b共享一个转录起始位点，含有两个PRF，位置分别在基因组3889nt(PRF1;nsp2)和7695nt(PRF2;nsp8/9)位，依靠-1RFS1和-2RFS1机制产生nsp2N和nsp2TF[25,27]，nsp9由-1RFS2产生。病毒编码的蛋白酶包括3种具有木瓜样蛋白酶(papain-likecysteineproteinases,PLP)活性的PLP1α(nsp1α)、PLP1β(nsp1β)、PLP2(nsp2)和具有丝氨酸蛋白酶(serineproteinase,SP)活性的nsp4[28]。最初的nsp1α和nsp1β通过自我切割分解产生，PLP1α和PLP1β分别分裂nsp1α和nsp1β、nsp1β和nsp2之间的连接，PLP2分裂nsp2和nsp3之间的连接，SP水解剩下的非结构蛋白nsp3~12[17,29]。nsp1α和nsp1β除了具有PLP活性可催化自身裂解外，还可对病毒在细胞内的复制至关重要，反向遗传学证明，nsp1α活性位点的突变可以完全阻止病毒sgRNAs的复制，但并不能影响其gRNAs的复制，而nsp1β活性位点的突变失活，却可以阻止gRNAs的复制，说明nsp1α和nsp1β的正确切割对病毒gRNAs的复制是必须的[30]。此外，nsp1可通过多种途径抑制机体免疫反应，例如，nsp1α通过降解CBP，抑制干扰素(interferon,IFN)的转录[31]；Beura等研究发现，nsp1β通过抑制IRF3的活化，负调控IFN调控因子，导致IFN转录下降[32]。nsp2是PRRSV最大的非结构蛋白，在结构上nsp2大致分为：N端半胱氨酸酶结构域、中间高变区、C端跨膜区和C端保守区[33]，其前端13aa~35aa不是病毒复制所必须的。nsp2可参与调节天然免疫应答和体液免疫应答，具有很强的免疫原性。研究发现，nsp2缺失中间特定区域后可以降低机体诱导产生的IL-1β和TNF-α[34]；在感染PRRSV的初期阶段，机体即可产生针对nsp2的抗体，且和针对N蛋白的抗体水平相似，但前者持续水平更长。有学者在nsp2蛋白上鉴定出了至少18个线性抗原表位，其中Yan等在BJ-4株中鉴定出2个线性表位(530~544aa和545~557aa)[35-38]，故可认为HP-PRRSV(nsp2蛋白缺失482、533~561位氨基酸)丢失了至少2个抗原表位，导致其免疫原性降低，毒性增强，但Zhou等使用反向遗传方法证明nsp2基因的30个氨基酸的缺失与PRRSV毒性增强无关[39]。nsp9具有RdRp活性，对PRRSV的复制和转录都是必须的[40]。nsp10编码RNA解旋酶(Hel)，其序列的N端含有13个保守的半胱氨酸和组氨酸残基锌结合区。nsp9和nsp10均参与形成位于感染细胞核周腔的RTC，参与PRRSV基因组的复制和sgRNA的形成。nsp11具有套式病毒鸟苷酸特异性核酸内切酶功能，可确保病毒复制过程的准确性，同时具有很强的去泛素化功能[41]。1.3.3结构蛋白结构基因位于基因组3’端，以负链不连续转录机制转录产生亚基因组(subgenomic4 北疆地区猪繁殖与呼吸综合征病毒分子流行病学调查及病毒全基因组分析RNAs,sgRNA)，最终产生6种正链sgRNAs(RNA2-7)，每种sgRNAs都含有和病毒基因组同样的5'UTR、3'UTR和poly(A)。除sgRNA7外，其他sgRNAs均呈多序反子，每个上游ORF的sgRNA均含有下游所有基因的ORF序列，但只有位于5'端的最上游的ORF才可以被翻译出来(sgRNA2除外)，如图1-1所示。PRRSV共有8个结构蛋白，分别由ORF2a/2b、ORF3、ORF4、ORF5a/5b、ORF6、ORF7转录后的sgRNA翻译而来的GP2(glycoprotein)、E(envelopeprotein)、GP3、GP4、ORF5a、GP5、膜蛋白M(membraneprotein)、核衣壳蛋白N(nucleocapsidprotein)组成。GP2、GP3、GP4、GP5为糖基化的膜蛋白,E、ORF5a、M、N为非糖基化蛋白；病毒粒子表面的囊膜蛋白主要是GP5和M，两者为病毒的必需蛋白，缺一不可，同时含有少量的GP2a、GP3、GP4和E蛋白[42]。GP2、GP3和GP4聚集形成与病毒进入功能有关的N-糖基化辅助糖蛋白复合物。sgRNA2编码ORF2a/b，表达GP2和小的非糖基化膜蛋白E。GP2大小为29~30kD，有2个明显的疏水峰和2个保守的潜在糖基化位点，但其糖基化位点被N-聚糖复合物覆盖，GP2主要通过二硫键与其他结构蛋白聚合形成多聚体，而发挥病毒入侵作用[27]。E蛋白为非糖基化的疏水蛋白，大小约10kD，可与N蛋白以非共价键结合形成二聚体，辅助病毒核心蛋白的组装，是病毒复制所必须的蛋白，但非病毒粒子必须蛋白。GP3由sgRNA3编码得ORF3产生，是可溶性高糖基化蛋白，具有7个潜在的保守糖基化位点[43]，其糖链修饰与GP5蛋白相似，可协助病毒的免疫逃避过程。GP3可产生中和抗体，具有较强的抗原性[44]。GP4由sgRNA4编码ORF4表达产生，位N糖基化蛋白，其C端和N端均含有高度疏水区，分子量大小约31~35kD，含有4个保守的潜在糖基化位点。在病毒拯救实验中发现，缺失ORF4后，不能成功拯救出病毒，提示GP4在此过程中起重要作用[45]。GP4可产生较弱水平的中和抗体，但保守相差[46]。sgRNA5编码ORF5a/b，产生GP5和ORF5a。GP5是PRRSV最重要的结构蛋白之一，且在所有结构蛋白中变异最为显著，大小为25kD，其N端约30aa是信号肽序列，之后是由约35aa组成的糖基化位点和包含60aa的疏水结构域(跨膜1~3次)，最后是由70aa组成的C端疏水区[47]。通过核苷酸和氨基酸序列比对发现，GP5蛋白有两个多变区57~70aa和121~130aa，一个多变区32~40aa，3个保守区41~56aa、71~120aa和121~130aa[48]。GP5胞外结构域包含PRRSV中和表位(primaryneutralizingepitope,PNE)和诱骗表位(decoyepitope,Decoy)，PNE可以刺激机体产生很强的中和抗体，大多数中和抗体均可识别GP5抗原表位，同时诱导宿主产生β干扰素(interferon-β,IFN-β),阻止PRRSV感染[49]；然而，PNE并不是免疫显性表位，其周围结构域存在显性表位的Decoy和其他糖基化位点，故在感染PRRSV初期，机体产生的高水平抗体，并非中和抗体，且干扰中和抗体的产生，在感染PRRSV后期才会产生针对病毒的中和抗体。由于GP5在特异性免疫中起非常重要的作用，可诱导非中和/中和抗体，因此学者多以GP5为对象，研究PRRSV遗传进化情况[11,50-51]。5 北疆地区猪繁殖与呼吸综合征病毒分子流行病学调查及病毒全基因组分析M蛋白由sgRNA6编码ORF6表达产生，分子量大小约18~19kD，是PRRSV最保守的蛋白[52]，可与GP5结合形成异源二聚体，为病毒感染过程所必须蛋白，同时M可增强机体对GP5的免疫反应，加快中和抗体的产生[53]。N蛋白由sgRNA7编码ORF7表达产生，分子量大小约13.8~15kD，在病毒粒子中含量最高，约20%~40%，在病毒粒子中以同源二聚体存在，与病毒RNA结合形成核衣壳[54-56]。在PRRSV感染初期，N蛋白即可诱导机体产生非中和抗体，可用来作为监控猪群PRRSV抗体水平[57]。1.4PRRSV基因组的复制和转录PRRSV进入靶细胞有赖于清道夫受体CD163、硫酸乙酰肝素和唾液酸粘附素受体。病毒可选择性的先通过GP5、M和硫酸乙酰肝素形成低亲和力的结合[58]，聚集在细胞表面，便于和更高亲和力的巨噬细胞特异性唾液酸粘附素结合，进入靶细胞，同时完成脱衣壳和释放基因组[59-60]。一旦病毒进入细胞，即开始基因组ORF1a和ORF1b的表达，借助宿主细胞内的相关酶和物质合成大的复制聚合酶，进而合成出与原正链互补的负链基因组，然后以负链为模板完成基因组复制，并转录出各种sgRNA，翻译出病毒结构蛋白[19]。复制功能的核心是RdRp-nsp9、具有锌结合域和RNA解旋酶功能的nsp10、具有套式病毒鸟苷酸特异性核酸内切酶功能的nsp11。与其他套式病毒一样PRRSV具有独特的复制转录机制，包括异常大的多顺反子RNA基因组和通过不连续转录，产生的含有相同5’和3’端的套式亚基因组(subgenomicRNAs,sgRNA)[61]。PRRSV的复制具有是3个重要特点：重排宿主细胞膜建立病毒复制复合体(replicationcomplexes,RC)、合成和表达基因组RNA(genomicRNA,gRNA)、转录sgRNA高效表达结构蛋白。gRNA和sgRNA来源于负链合成机制，通过不连续的转录策略调节反义转录产生gRNA和6种正链sgRNAs(RNA2-7)[62]。PRRSV的基因组具有和mRNA一样的转录功能，同时也可进行gRNA的复制。每种sgRNAs都含有和病毒基因组同样的5'UTR、3'UTR和poly(A)。除sgRNA7外，其他sgRNAs均呈多序反子，每个上游ORF的sgRNA均含有下游所有基因的ORF序列，但只有位于5'端的最上游的ORF才可以被翻译出来(sgRNA2除外)，如图3所示。最后，病毒基因组和结构蛋白进行组装，通过胞吐作用释放出细胞[63]。1.5PRRSV致病机制PRRSV主要通过呼吸道及生殖系统侵染猪群[64]，病毒首先感染PAMs[65]，通过与PAMs表面的唾液酸粘附素受体或类肝素受体结合，被细胞内吞进入细胞后大量复制增殖，引起巨噬细胞损伤，临床表现为呼吸功能障碍[66]。随着巨噬细胞崩解，PRRSV通6 北疆地区猪繁殖与呼吸综合征病毒分子流行病学调查及病毒全基因组分析过血液循环系统继续入侵机体各处淋巴组织，最终造成巨噬细胞和单核细胞损伤，猪体天然免疫和特异性免疫损伤，继发其他细菌和病毒感染[67]。虽然在PRRSV感染后机体可迅速产生抗体，但前期产生的大多为非中和抗体，而后期产生的中和抗体也由于PRRSV对宿主免疫系统的破坏、抑制和逃避及ADE效应而效果甚微，造成PRRSV的持续感染[68]。1.6PRRSV免疫学PRRSV具有破坏宿主机体天然免疫的能力，同时抑制特异性免疫作用，表现为PRRSV对先天性免疫系统、体液免疫和细胞免疫三方面的影响。1.6.1PRRSV对先天性免疫系统影响动物机体的先天免疫系统对防御微生物入侵和特异性免疫应答均具有重要作用，是抵抗病毒感染的第一道防线。PRRSV诱导PAMs和单核巨噬细胞凋亡，损害自然杀伤细胞(naturalkillercell，NK)的功能，抑制干扰素(interferon,IFN)的合成和信号转导[69]，同时诱导免疫抑制因子IL-10、TGF-β等上调[70]。PRRSV可造成机体抗炎因子和抑炎因子的失衡，随着肺部的病理变化及病毒血症的发生，血清中TNF-α、IL-6、IL-1β等促炎因子含量随之升高[71]。PRRSV的感染，还可激活如Toll样受体(1/2/4/6)、CD163、CD14、视黄酸诱导基因I(retinoicacidinduciblegene-I,)等模式识别受体(patternrecognitionreceptor，PRR)共同参与炎症反应[72]。PRRSV通过NF-κB和MAPK信号途径来诱导产生IL-10，且不同毒株诱导的能力有所不同，高致病毒株普遍强于底致病毒株，而IL-10可通过Toll样受体信号通路抑制机体先天免疫系统[73-74]；研究发现，PRRSVnsp1、GP5和N蛋白都有诱导IL-10上调能力。干扰素(IFN)可通过不同途径激活先天免疫系统抵抗病毒感染，PRRSV对IFN尤为敏感，可有效抑制PRRSV的增殖，而PRRSV可通过不同途径抵抗IFN的抑制作用，使机体不能诱导IFN产生，从而逃避机体免疫应答，其中如nsp1α和nsp1β可能够产生抑制作用[75]。PRR对PRRSV的识别是产生IFN的必要条件，但PRRSV感染初期可逃避如Toll样受体[76]、视黄酸诱导基因IRIG-I[72]、黑色素瘤分化相关基因5(MDA5)和核苷酸结合寡聚化结构域样受体等PRR[77]，可为病毒的复制提供有利条件。此外，PRRSV可诱导如淋巴细胞、PAMs、猪睾丸生殖细胞等感染细胞的凋亡[78]，而早期/后期诱导PAMs凋亡主要依赖于抑制细胞凋亡诱导剂/半脱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶[79]，表明PRRSV可通过一定程度的引导细胞凋亡时间来保证自身的复制，同时达到免疫逃逸和抑制宿主免疫应答。1.6.2PRRSV对体液免疫影响在体液免疫方面，PRRSV感染后，第七天即可检测到猪体内的抗体，两周后IgM可到达峰值，第三至七周IgG可到达峰值。研究发现，按产生时间顺序分，猪体内产生的针对性抗体为：N蛋白、M蛋白和GP5，由于针对N蛋白的抗体最早最持久，故常被应用于PRRSV的感染诊断。上述抗体并非中和抗体，但这些非中和抗体却因PRRSV7 北疆地区猪繁殖与呼吸综合征病毒分子流行病学调查及病毒全基因组分析的ADE效应促进病毒的复制，PRRSV低水平的中和抗体一般在感染后第21-28天产生。研究认为导致这种现象的主要原因是GP5的免疫显性表位为诱骗表位，导致针对病毒的中和抗体较为迟缓，同时水平低下[80]。1.6.3PRRSV对细胞免疫影响在细胞免疫方面，病毒的表面抗原可被CD8+T细胞识别，感染的细胞被清除，从而阻止病毒的扩散，其中起重要作用的是细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxiclymphocyte,CTL)。虽然PRRSV的M、GP5、nsp9等蛋白上均被鉴定出了很多CTL表位[81-83]，但PRRSV可以抑制宿主的细胞免疫[84]。相比于其他病毒感染，PRRSV诱导的γ-干扰素(Interferon-γ,IFN-γ)的产生比较缓慢，导致在感染或免疫后28天左右淋巴细胞增殖才会出现，造成在感染早期不能有效抑制PRRSV的增殖[85]。此外，PRRSV的感染还可造成外周血CD3+、CD4+/CD8+T等细胞比例降低，淋巴细胞增殖受阻[84]。1.7PRRSV流行趋势1987年在美地区PRRS被Keffaber首次报道[2]，随后1991年PRRSV被Wensvoort首次用PAM分离得到，欧洲型代表毒株Lelystandvirus(LV)[86]；1992年CollinsJ.E.,etal分离得到美洲型代表毒株ATCCVR-2332[4]。在我国，根据PRRSV流行20多年的历程可大致分为三个阶段：第一阶段，美洲型C-PRRSV流行期。自1996年郭宝清分离出C-PRRSV，PRRS在我国迅速蔓延，全国各地均发现这种基因型毒株，代表毒株为CH1-a、BJ-4株[3-4]。第二阶段，HP-PRRSV流行期。2006年我国爆发由HP-PRRSV引起的HP-PRRS，经研究发现HP-PRRSV由PRRSV变异而来，代表毒株为JXA1和HuN4株[6]，临床主要表现为40-42℃高热症，在短时间内波及我国20多个省份，其中长江流域的省份疫情相对比较严重，感染超过200万头猪，造成40万头猪死亡，造成了巨大的经济损失，2007年随着PRRSV灭活疫苗的使用，疫情得到了有效控制，虽然此后仍有点状和区域性爆发PRRS疫情，但随着HP-PRRSV灭活疫苗的使用，发病率显著降低。第三阶段，多基因型PRRSV稳定流行期。2008年，PRRSVNADC30毒株在美国分离[7]，随后经引种传播至我国，因为遗传进化关系较近，在国内普遍被称为NADC-30like毒株。2015年经安同庆鉴定发现在我国流行的NADC-30like毒株为新型高致病型PRRSV，代表毒株为HENAN-XINX和JL580[5]。至此，C-PRRSV、HP-PRRSV、NADC-30like和疫苗毒株在我国各地区混合存在，但由于养殖业防控意识的加强、各种快速诊断技术的建立、合理的疫苗使用，使PRRSV疫情得到有效的控制，病死率显著降低。8 北疆地区猪繁殖与呼吸综合征病毒分子流行病学调查及病毒全基因组分析1.8遗传变异及基因重组PRRSV所属的动脉炎病毒属具有的显著特征是高频率的基因突变和重组，易变异造成毒株的多样性，从而毒株间产生较大的毒力差异。由于RdRp缺乏核酸校正能力和疫苗的使用共同造成的选择压力，使PRRSV得遗产变异和重组尤为显著。目前，根据致病性PRRSV可分为可分为C-PRRSV和HP-PRRSV。1.8.1遗传变异非结构蛋白基因中，ORF1a变异程度较高，其中nsp2变异最为显著，其次为nsp1β，而ORF1b比较保守。nsp2可耐受100aa~200aa缺失，最高可容许的400aa的缺失[38]，nsp2同时也是PRRSV发生变异频率最高的基因，与病毒致病性的改变存在极其重要的关系，故常用来作为PRRSV遗传进化分析的靶基因。目前流行的HP-PRRSV均具有明显的nsp2缺失特征，相较于C-PRRSV，2006年爆发的HP-PRRSV和2012年发现的NADC-30like毒株nsp2蛋白分别存在30(1+29)、131(111+1+19)个不连续aa缺失[7]。在我国最早报道的PRRSVnsp2基因发生缺失的为2005年高志强等发现的经典HB-2(sh)/2002毒株，其nsp2蛋白有12个aa的连续缺失，推测可能为C-PRRSV和HP-PRRSV之间的一类变异过渡毒株。相较我国HP-PRRSV，在美国发现的PRRSVNADC-30毒株毒力较弱，通过序列比对显示在美国发现的NADC-30、MN184A、MN184B和MN184C毒株遗传进化关系较近，推测NADC-30毒株为MN184系列毒株进化而来。nsp2基因核苷酸序列比对发现，我国河南地区分离的HENAN-XINX、HENAN-HEB等毒株与NADC30毒株高度相似，为85.9%~95.2%，而与高致病及经典PRRSV关系较远，分别为63.7%~74.5%和67.0%~69.1%，故又称这些具有新型变异特征的我国PRRSV毒株为NADC-30like毒株，通过进一步重组分析推测这些NADC-30like毒株为我国HP-PRRSV与NADC系列毒株基因重组进化而来[5]。最初推断nsp2氨基酸的缺失可以增强毒株的致病力，但Zhou等通过反向遗传学方法证实nsp2氨基酸的缺失和插入与其毒力变化并无必然联系，并不能导致毒株致病性的增强，故影响PRRSV致病性的机理仍需进一步探索。在PRRSV结构蛋白中，GP5变异程度最高，其次为GP3，M和N蛋白较为保守。EU-PRRSV和NA-PRRSV的GP3和GP5氨基酸序列同源性较低，同型间氨基酸序列也存在明显差异。研究表明，GP5上有大量的中和抗体识别位点、结合位点，其变异可显著影响抗体的诱导和有效识别。因此PRRSVnsp2和ORF5基因常作为遗传进化研究靶基因[87]。9 北疆地区猪繁殖与呼吸综合征病毒分子流行病学调查及病毒全基因组分析1.8.2基因重组PRRSV的另一个特征是易发生基因重组，导致PRRS的流行更为复杂、多样。根据病毒RNA分子信息交换位点不同，可分为同源或非同源RNA重组[88]，相比于非同源重组，同源重组产生的重组病毒存活率更高。目前发现EU-PRRSV和NA-PRRSV毒株均存在基因重组现象，但是不同型毒株间的重组尚未发现[89]。1996年KapurV对10株Ⅱ型PRRSV毒株的ORF2~7分析发现，除ORF6以外，其他区域均存在不同程度的基因重组现象。Liu等建立了JXwn06(HP-PRRSV)和HB-1/3.9(C-PRRSV)两株Ⅱ型感染的动物实验模型，在感染两株毒株后7~21天后鉴定出133例重组病毒，其中ORF5、ORF3和nsp2基因的重组导致嵌合的GP5、GP3和nsp2，表现出复杂的重组模式[90]。Mengeling等根据重组毒株的致病性，把重组事件分为：弱毒株与弱毒株、弱毒株与强毒株和强毒株之间三种类型，PRRSV的重组会产生不同致病性的新变异株，易产生更强毒力的毒株，从而导致PRRSV不断快速进化，PRRS疫情的不断发生[91]。自2006年我国爆发HP-PRRSV以来，HP-PRRS的流行变得更为复杂和多样化。在2009年和2010年中国和其他东南亚国家的第二次重大暴发中，HP-PRRSV毒株被证明是两种中国PRRSV毒株之间的一种重组[92]。2015年，在我国流行的NADC30-like毒株（如，JL580），也被发现是由于引种而传入的亲本NADC30毒株与我国HP-PRRSV毒株重组所致，被鉴定为高致病毒株。因此，研究PRRSV的重组机制对分析PRRSV遗传变异及其防控均具有重要意义。1.9PRRSV的检测与诊断技术在猪群中，病猪和带毒猪是PRRSV的主要传播源，其中亚临床感染是不明传播的潜在来源，带毒猪是病毒传播的主要来源。虽然PRRSV可通过病猪分泌物、排泄物、饲料、公猪精液、死产胎儿等多种途径传播，但主要方式是垂直传播和和呼吸道水平传播。此外，感染PRRSV后，以易继发感染猪伪狂犬病病毒(porcinepseudorabiesvirus,PRV)、猪肺炎支原体(Mycoplasmahyopneumoniae，Mh)、猪圆环病毒2型(porcinecircovirustype2，PCV2)等病原混合感染[93]，并且PRRSV、PCV2、PRV这几种病原均可不同程度的对机体免疫系统造成损伤，降低机体免疫力[94]，从而加剧混合感染与发病程度，给临床诊断带来极大困难。因此，在PRRSV研究领域内建立快捷、简单、灵敏的病毒诊断方法一直是热门研究之一。目前用于PRRSV诊断的方法主要为病原学和血清学途径。病原学方法主要包括：病毒分离与鉴定、RT-PCR等方法；血清学方法主要包括：酶联免疫吸附试验(ELISA)、间接免疫荧光试验、免疫过氧化物酶单层细胞试验和胶体金免疫层析法等。在血清学检测方面，其低成本、快速、操作简单、特异性强和灵敏度高等优点一直是猪群PRRSV抗体水平检测评估的重要方法，在实际生产中得到广泛应用。ELISA方10 北疆地区猪繁殖与呼吸综合征病毒分子流行病学调查及病毒全基因组分析法主要用于PRRSV抗体水平检测与评估，因其操作简单、灵敏度高、对实验条件要求低等优势得到广泛应用，尤其适用于对于大量血清样本短时间内检测，目前国内外学者建立了多种直接/间接ELISA方法，而主要的免疫原性蛋白为GP5和N蛋白；血清中和试验可区分不同PRRSV毒株，PRRSV抗体的检测特异性强，但PRRSV的中和抗体产生的较晚，不适合作为早期诊断使用。在病原检测方面，病毒分离是诊断PRRSV最准确的方法，也是鉴定毒株致病性的必要手段之一。1991年Wensvoort等分离鉴定了PRRSV，我国1996年郭宝清等分离到该病原。最适合用来作为病毒分离的样品为猪的肺脏，而试验中最适宜分离PRRSV的为PAM细胞，其次是Marc-145传代细胞。但该方法需要病料处理、连续的细胞传代培养致使其耗时较长的先天因素已经决定这种方法不适合临床快速诊断操作。间接免疫荧光实验主要是通过病毒培养，在荧光显微镜下利用荧光抗体来检测细胞中的病毒，郭宝清等利用IFA方法检测病猪血清，证实我国存在PRRSV，但该方法所需要得细胞培养技术较为复杂，且只能通过荧光显微镜观察来检测查看结果，容易受实验人员操作影响。随着近20年PRRSV不断变异，特别是2006年爆发的HP-PRRSV，使得在所有检测方法中可快速区分C-PRRSV、HP-PRRSV、NADC30-like、疫苗株等的RT-PCR方法得到广泛推广和应用。常规的RT-PCR是目前应用最广的PRRSV病原检测方法，主要包括RT-PCR、实时定量RT-PCR、实时荧光定量RT-PCR，其主要根据核苷酸序列较为保守的M/N蛋白基因设计，由于NA3和NA4PRRSV具有独特的nsp2缺失，近年来，国内外学者建立了很多基于此原理的PRRSVRT-PCR诊断方法。赫晓芳等根据HP-PRRSV设计的PRRSV区分诊断RT-PCR方法对病原检测，利用高致病毒株30aa的典型缺失，在缺失区域两端设计引物，可同时扩增HP-PRRSV(230bp)和C-PRRSV(320bp)，且易于区分，最小量为10TCID50[95]。周峰等利用NADC30-like毒株131aa的缺失特征，设计特异性的可区分HP-PRRSV和NADC30-like毒株引物，对这两型毒株扩增的长度分别为1120bp和1513bp[96]。张硕建立的荧光定量RT-PCR方法，能特异性的检测在我国流行的所有EU-PRRSV和NA-PRRSV毒株，检测下限分别为22copies/uL和22copies/uL[97]。2.1本研究的目的和意义自2006年HP-PRRS爆发以来，我国各个地区对PRRSV的遗传进化都进行了持续详细的研究，对不同PRRSV变异株特征都进行了及时的跟踪报道。在新疆地区，2003~2014年间，马伟等证实存在PRRS[98]，随后简子建、苏贵成、张美玲等对PRRSVXJ-a、XJ-b、XJ-c、XJ-Q等分离株进行详细研究分析，发现这4株均为HP-PRRSV[99-101]，王旭哲、赵丽、陆桂丽等对新疆地区PRRSV的遗传进化进行分析，发现本地区呈经典和高致病PRRSV毒株共存，高致病毒株呈蔓延趋势[102-103]，但近几年鲜有关于本地区11 北疆地区猪繁殖与呼吸综合征病毒分子流行病学调查及病毒全基因组分析PRRSV详细遗传进化研究。我国地域辽阔，不同地区猪的引种、地理条件以及饲养环境改变，易导致不同地区PRRSV的致病特点出现差异，PRRSV的高突变性也决定其在不同时间段表现出独特的进化特征。通过与全国其他地区相比，新疆地区PRRSV遗传进化研究较为薄弱，并且尚未有新疆地区PRRSV经典毒株与高致病毒株区分诊断方法的报道，随着2014年PRRSVNADC30-like毒株在吉林、北京、天津、陕西、河南等地区的蔓延，加强新疆地区PRRSV遗传进化研究与建立本地区PRRSV经典毒株与高致病毒株区分诊断方法尤为迫切。因此本研究从北疆地区PRRSV部分基因和全基因遗传变异研究入手，了解北疆地区PRRSV毒株进化特征，并以此为基础建立PRRSVRT-PCR鉴别诊断方法，进行PRRSV分子流行病学调查，及时准确的为北疆地区PRRSV的防治提供参考。12 北疆地区猪繁殖与呼吸综合征病毒分子流行病学调查及病毒全基因组分析第二章试验部分试验一北疆地区PRRSVnsp2和GP5基因遗传变异分析摘要：为了解北疆地区PRRSV流行毒株的遗传变异情况。本研究采用PT-PCR方法，对采集自石河子及周边地区的疑似PRRS病料使用ORF7引物进行PRRSV检测，并选取部分阳性样本利用nsp2、ORF5引物扩增PRRSV基因片段，利用生物信息学软件分析本地区PRRSV遗传变异情况。结果表明，100份样品中33份PRRSV阳性；选取13份阳性样本进行测序，测序获得8段PRRSV毒株nsp2部分基因、12段ORF5基因和13段ORF7基因，分析显示本实验所得到的PRRSV基因序列均与美洲型毒株一致性较高，其中7株PRRSVnsp2基因具有HP-PRRSV30个不连续氨基酸缺失特征；另外1株与HK13毒株一致性较高，系统进化树显示其与HB-2(sh)/2002和CH-1a等C-PRRSV毒株较为临近，且其nsp2基因存在与高致病毒株不同位置的5个连续氨基酸缺失，这种缺失型尚未见报道，推测为C-PRRSV变异株，命名为XJzx1株。以上结果表明，近几年在新疆地区所流行的PRRSV为美洲型，呈经典毒株与高致病毒株共存，且以高致病毒株为主的流行情况；本次研究虽未发现在国内中部及北部地区流行的NACD30-like毒株，但新变异株XJzx1的发现也提示我们需要加强本地区PRRSV的监测工作。关键字：猪繁殖与呼吸综合征病毒；nsp2；ORF5；流行病学；遗传进化分析猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)，又称“蓝耳病”，是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)引起的一种严重危害猪业生产的高度传染病[1]。我国于1996年分离出经典PRRSV毒株(C-PRRSV)，代表毒株为CH1-a和BJ-4[3-4]。2006年我国爆发了由高致病猪繁殖与呼吸综合征病毒(HP-PRRSV)引起的重大疫情，对养猪业造成了巨大损失。2008年，PRRSVNADC30毒株在美国分离[5]，2012年周峰报道我国存在PRRSVNADC30-like毒株[6]，随后快速蔓延于我国大部分地区，经鉴定在我国流行的PRRSVNADC-30like毒株为高致病型[7]。鉴于其造成的巨大的经济损失，我国将其调整为为一类传染病[8]，而普通致病性的PRRS为我国二类传染病。PRRSV为单股正链RNA病毒，基因全长约15kb，含10个开放阅读框(ORF)：ORF1a、ORF1b、ORF2a、ORF2b、ORF3~ORF5a、ORF5b~ORF7[4-5]。ORF1a中的nsp2区域最易发生突变、缺失和插入，HP-PRRSV及NADC30-like毒株都存在典型nsp2缺失。GP5糖基化囊膜蛋白是变异最显著的结构蛋白，有较多中和/非中和表位，在特异性免疫中起重要的作用。因此学者多以nsp2和GP5基因为靶基因，研究PRRSV遗传进化情况[11,50-51]，根据其基因和抗原差异，可将PRRSV分为欧洲型和美洲型，代表毒株分别为LV和VR-2332株。HP-PRRSV由PRRSV变异而来，代表毒株为JXA1和HUN4株[104]，而NADC30-like毒株代表毒株为HENAN-XINX和JL580株[5]。我国流行较广的美洲型13 北疆地区猪繁殖与呼吸综合征病毒分子流行病学调查及病毒全基因组分析毒株毒株可分为NA1、NA2、NA3和NA4型，其中NA1/NA2为C-PRRSV毒株，NA3/NA4型为HP-PRRSV毒株，欧洲型毒株存在区域较少。2003年,马伟[98]证实新疆存在PRRS，简子建等、苏贵成等、张美玲等对PRRSVXJ-a、XJ-b、XJ-c、XJ-Q新疆分离株进行部分基因遗传变异研究分离研究，发现这4株PRRSV均为NA4型PRRSV毒株[99-101]，王旭哲等、赵丽等、陆桂丽等对新疆部分地区PRRSV的遗传进化进行分析发现，本地区PRRSV呈NA1、NA2和NA4株共存，且NA4型高致病毒株呈蔓延趋势现象[102-103]。目前，国内学者持续跟踪报道我国各地区PRRSV的流行病学和遗传变异情况，尤其是我国东部及中部地区，但新疆地区这方面研究较为薄弱，且近几年少有最新研究进展报道。因此，本研究通过对北疆地区采集到的PRRS疑似样本利用PRRSVORF7基因的保守型，进行PRRSV鉴定，同时分析部分样品中病毒的nsp2和ORF5基因遗传进化关系，研究本地区PRRSV遗传变异情况，以期更好的为新疆PRRS的防控提供理论依据。1材料与方法1.1材料实验用100份疑似PRRS的猪肺、脾、肾、淋巴结组织均采自石河子、乌鲁木齐、昌吉、伊犁等北疆地区猪场。感受态细胞DH5α由本实验室自备。TRIzol试剂购自invitrogen公司；ReverseTranscriptionSystem试剂盒、pGEM-TEasyVetor试剂盒购自Promega公司；2×TaqPCRMix、MarkerⅢ、琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒和质粒小提试剂盒均购自天根生化科技(北京)有限公司；氨苄青霉素购自biosharp公司；氯仿、无水乙醇、异丙醇等为国产分析纯试剂。1.2方法1.2.1引物的设计与合成参考文献[95-96]合成扩增PRRSVnsp2部分基因、ORF5和ORF7基因的3对特异性引物(表2-1)，使用由生工生物工程有限公司合成。14 北疆地区猪繁殖与呼吸综合征病毒分子流行病学调查及病毒全基因组分析表2-1PRRSVnsp2部分基因、ORF5和ORF7基因扩增引物Table2-1TheprimersofPRRSVpartialnsp2gene,ORF5andORF7gene目的基因引物名称引物序列(5'-3')位置长度nsp2-F1ACCCTTCCYGAAAGAGTRAGnsp21388-29151120/1513bpnsp2-R1GTGAGGAHGCAGACAAATGP5-FTGGCAATTTGAATGTTCAAGTATGGP5(ORF5)13677-14301640bpGP5-RCTGTGCTATCATTGCAGAAGTCGTORF7-FGTGGTAAACCTTGTCAAATATGCCAN(ORF7)14871-15295424bpORF7-RCTAACACTGAGGTGCCCAAAGAATAC1.2.2RNA的提取及RT-PCR病样组织总RNA提取参照TRIzol说明书进行。RNA的反转录反应在20μL体系中进行,包括提取的样品总RNA2μL、5×ReactionBuffer4μL、MgCl2(25mmol/L)4μL、PCRNucleotideMix(10mM)2μL、Oligo(dT)Primer(500μg/mL)1μL、RandomPrimers1μL、RecombinantRNasinRibonucleaseInhibitor1μL、ReverseTranscriptase1μL，用DEPC水补足至20μL。反应程序为42℃水浴1h，75℃5min，4℃冷却5min。得到的cDNA直接用于PCR扩增。PCR反应在25μL体系中进行，其中：2×TaqPCRMasterMix12.5μL、上下游引物（10μmoL/L）各1μL、cDNA2μL（阴性对照ddH2O2μL），用ddH2O补足至25μL。nsp2反应程序为：95℃预变性5min；95℃变性30s，50℃退火40s，72℃延伸90s，35个循环；72℃延伸10min，-20℃保存或对PCR产物进行1.5%琼脂糖凝胶电泳检测。GP5/N反应程序为：95℃预变性5min；95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸60s，35个循环；72℃延伸10min，-20℃保存或进行2.0%琼脂糖凝胶电泳检测。1.2.3目的基因的克隆、序列测定和分析PCR产物经琼脂糖凝胶电泳回收纯化后，连接入pGEM-T克隆载体，反应在10μL体系中进行，其中：2×RapidLigationBuffer5μL,pGEM-TEasyVector1μL,PCRproduct3μL，T4DNALigase1μL。反应程序为：室温1h，4℃过夜。将连接产物转化至含有100μL感受态细胞的EP管中，再向管中加入900μLLB液体培养基(不含氨苄青霉素),混匀后37℃振荡培养1h，取100μL涂布于最终浓度为100μg/mLAmp的LB固体筛选平板上，37℃过夜培养，挑取单克隆菌于100μg/mLAmp的LB液体培养基中摇菌，经PCR鉴定为阳性后，由生工生物工程(上海)股份有限公司测序。15 北疆地区猪繁殖与呼吸综合征病毒分子流行病学调查及病毒全基因组分析将测序结果利用DNAMAN进行拼接，与GenBank中nsp2、GP5基因核苷酸序列比对，选取与本研究毒株同源性较高的毒株、国内外代表毒株及疫苗毒株共计26株，除Lelystadvirus株为欧洲型外，其余25株均为美洲型毒株，包括：美洲型原型VR-2332株，8株经典毒株(NA1/NA2型)CH-1a、BJ-4、HB-1(sh)/2002、HB-2(sh)/2002、HN1、HK13、HK6、JA142，8株高致病毒株(NA4型)SX2009、HUN4、JXA1、HUB1、HuN、HPBEDV、Henan-1、HEB1，美国的MN184A、MN184C、NADC30毒株和我国DNAC30-like毒株(NA3型)JL580、HENAN-XINX、HENAN-HEB，2株疫苗毒株MLVRespPRRS/Repro和PrimePac(表2-2)。使用DNAMAN推导基因氨基酸序列，ClustalX2、DNAMAN7进行基因序列比对和数据转化，DNAStarMegAlin进行序列一致性分析，利用IQ-Tree软件中的ModelFinder计算核酸替代模型计算，使用PhyML3.1软件绘制最大似然法系统进化树进行分析[106-107]，使用FigTreev1.4.3进行进化树修饰(Java运行环境)。表2-2本试验参考的PRRSV基因序列Table2-2Sequencesusedinthisstydy毒株GenBank登录号登录时间来源毒株GenBank登录号登录时间来源CH-1aAY0326261996中国HK13KF2871402013中国BJ-4AF3318312000中国HK6KF2871352014中国HB-1(sh)/2002AY1503122002中国JL580KR7063432015中国HB-2(sh)/2002AY2623522002中国HENAN-XINXKF6119052015中国HN1AY4576352003中国HENAN-HEBKJ1436212014中国HUN4EF63500612006中国JA142AY4242712004美国JXA1EF1124452006中国PrimePacDQ779791.12006美国HEB1EF1124472006中国VR-2332U873921992美国MLVHUB1EF0759452006中国AF159149.11998美国RespPRRS/ReproHuNEF5179622007中国MN184ADQ1760192006美国HPBEDVEU2362592007中国MN184CEF4887392008美国Henan-1EU2009622007中国NADC30JN6544592012美国SX2009FJ8953292009中国Lelystadvirus(LV)M962621991欧洲16 北疆地区猪繁殖与呼吸综合征病毒分子流行病学调查及病毒全基因组分析2结果与分析2.1RT-PCR检测PRRSV使用ORF7-F/R引物，利用RT-PCR对采集自石河子及周边猪场的疑似PRRS的100份样品进行检测，结果显示其中33份为PRRSV阳性，阳性率为33%。选取13份阳性病料发现的毒株命名为PRRSVXJzx1～13，进一步分析本地区PRRSV流行情况。2.2部分PRRSV样品RT-PCR扩增结果13份PRRSV阳性样本RT-PCR扩增，得到8段nsp2部分基因，依次为XJzx1～XJzx8；12段ORF5基因，依次为XJzx1、XJzx3～13；13段ORF7基因，依次为XJzx1～XJzx13。2.3部分PRRSV样品病毒序列测定对13份PRRSV阳性样本使用RT-PCR方法扩增nsp2部分基因及ORF5,并进行克隆测序。经BLAST鉴定，后将结果上传到GenBank,获得的登录号见表2-3。表2-3本试验提交的nsp2部分基因、ORF5、ORF7基因序列Table2-3Thesequencesofpartialnsp2gene,ORF5andORF7genesubmittedbyourlaboratorynsp2基因ORF5基因ORF7基因XJzx1KP872498XJzx1KR080330XJzx1KR080342XJzx2KP872499XJzx2KR080343XJzx3KP890343XJzx3KR080331XJzx3KR080344XJzx4KP890344XJzx4KR080332XJzx4KR080345XJzx5KP890345XJzx5KR080333XJzx5KR080346XJzx6KP890346XJzx6KR080334XJzx6KR080347XJzx7KP890347XJzx7KR080335XJzx7KR080348XJzx8KP890348XJzx8KR080336XJzx8KR080349XJzx9KR080337XJzx9KR080350XJzx10KR080338XJzx10KR080351XJzx11KR080339XJzx11KR080352XJzx12KR080340XJzx12KR080353XJzx13KR080341XJzx13KR08035417 北疆地区猪繁殖与呼吸综合征病毒分子流行病学调查及病毒全基因组分析2.3nsp2基因变异特征2.3.1nsp2序列分析利用DNAStarMegAlin软件对本实验获得的PRRSVnsp2部分基因（氨基酸）基因序列一致性进行分析，结果显示：这8株PRRSV(XJzx1～XJzx8)nsp2部分基因序列一致性为88.0～100%(80.8%～100%)；与国内NA1/2型代表毒株CH-1a和BJ-4基因序列一致性分别为86.2%～90.3%(80.3%～86.0)、74.7%～79.5(66.6%～70.2%)；与国内NA3型代表毒株HENAN-XINX和JL580基因序列一致性分别为64.8～66.4%(52.4%～54.7%)、64.8%～66.0%(52.0%～54.0%)；与国内NA4型代表毒株JXA1和HUN4基因序列一致性分别为88.7～99.25%（85.0%～98.1%）、88.7%～99.0%(84.6%～97.7%)；与美洲型和欧洲型代表毒株VR-2332、LV株基因序列一致性分别为75.1%～79.9%(67.6%～71.3%)、45.5%～46.7%(21.2%～24.5%)。使用ClustalX比对氨基酸序列比对发现PRRSVXJzx2～XJzx8均具有NA4型毒株的30个(1+29)aa典型缺失(图2-1)。进一步对XJzx1株分析发现，其与8株NA1/NA2型毒株相似性介于69.9%～87.5%，其中与HK13、HB-1(sh)/2002、CH-1a相似性较高，分别为：87.5%，86.7%和84.8%；与8株高致病毒株相似性介于77.4%～78.3%；与美洲型原型VR-2332株相似性为73.8%。DNAMAN氨基酸序列分析显示XJzx1株nsp2部分基因在472～476位发生了5个氨基酸的缺失，与国内高致病PRRSV分离株nsp2482位、533～561位30个氨基酸的不连续典型缺失不同，但位于国内经典毒株HB-2(sh)/2002nsp2基因471～482位点连续12个氨基酸缺失区域内(图2-2)。序列一致性分析结果表明，本实验检测到的PRRSV均为美洲型毒株，且与国内NA1、NA2和NA4型PRRSV毒株一致性较高，国内NA3型毒株一致性较低。图2-1PRRSVnsp2部分氨基酸序列比对Fig.2-1Alignmenntofaminoacidsequencesofpartialnsp2ofPRRSV18 北疆地区猪繁殖与呼吸综合征病毒分子流行病学调查及病毒全基因组分析图2-2PRRSVXJzx1株nsp2部分氨基酸序列比对Fig.2-2Alignmenntofaminoacidsequencesofpartialnsp2geneofPRRSVXJzx1strain2.3.2nsp2系统发育树分析使用PhyML软件绘制本试验毒株和参考毒株(无LV株)系统进化树进行，最优树寻找方法的设置为SPR(最费时，但最能反应种的关系),bootstrap分析设置为100次。核苷酸最佳替代模型为GTR+G，碱基替代的类别数为4；可变位点的比例分别为1.714；氨基酸最佳替代模型为HIVw+G+F，碱基替代的类别数为4；可变位点的比例分别为1.355。分别代入PhyML3.1构建进化图。绘制nsp2部分基因核苷酸序列进化分析显示：XJzx2～8与NA4型毒株较为临近，而与NA1、NA2型和NA3型毒株及疫苗株关系较远；而XJzx1毒株与我国NA2型CH-1a、HB-2(sh)/2002、HK13毒株较为临近，与NA3和NA4型关系较远(图2-3)。nsp2部分基因氨基酸序列进化分析显示：XJzx2～8与NA4型毒株较为临近，而与NA1、NA2型和NA3型毒株及疫苗株关系较远；XJzx1与NA2型CH-1a、HB-1(sh)/2002、HK13毒株较为临近，与NA3和NA4型毒株关系较远(图2-4)。综上数据推测说明XJzx1为NA2型，即C-PRRSV毒株；XJzx2、XJzx3、XJzx4、XJzx5、XJzx6、XJzx7、XJzx2～8为NA4型毒株，即HP-PRRSV。19 北疆地区猪繁殖与呼吸综合征病毒分子流行病学调查及病毒全基因组分析图2-3猪繁殖与呼吸综合征病毒nsp2部分基因核苷酸序列进化分析Fig2-3Phylogeneticanalysisofpartialnsp2genenucleotidesequenceofPRRSV注：进化树中，黑色分支为NA1/2型PRRSV毒株，红色为NADC30-like毒株，蓝色为NA4型HP-PRRSV毒株，绿色为疫苗毒株.图2-4猪繁殖与呼吸综合征病毒nsp2部分氨基酸序列进化分析Fig2-4Phylogeneticanalysisofpartialnsp2aminoacidsequencesofPRRSV注：黑色分支为NA1/2型PRRSV毒株，红色为NADC30-like毒株，蓝色为NA4型HP-PRRSV毒株，绿色为疫苗毒株.20 北疆地区猪繁殖与呼吸综合征病毒分子流行病学调查及病毒全基因组分析2.4GP5基因变异特征2.4.1GP5序列一致性分析利用ClustalX和DNAStarMegAlin软件对本实验获得的PRRSVGP5(氨基酸)基因序列一致性进行分析，结果显示：这13株PRRSV(XJzx1、XJzx3～XJzx13)GP5基因序列一致性为83.5～100%(80.5%～100%)，与国内NA1/NA2型代表毒株CH-1a和BJ-4基因序列一致性分别为84.6%～95.0%(83.5%～92.0)、82.9%～98.2(82.0%～97.0%)；与国内NA4型代表毒株JXA1和HUN4基因序列一致性分别为83.1～99.2%（82.0%～98.0%）、83.1%～99.0%(82.0%～98.5%)；与国内NA3型代表毒株HENAN-XINX和JL580基因序列一致性分别为84.1～85.9%(82.5%～85.0%)、84.7%～86.7%(81.5%～85.0%)；与美洲型和欧洲型代表毒株VR-2332、LV株基因序列一致性分别为83.1%～99.2%(82.0%～98.0%)、60.9%～63.0%(57.1%～59.2%)。一致性分析结果表明，本实验检测到的PRRSV均为美洲型毒株、与国内NA1、NA2和NA3型毒株一致性较高，国内NDAC30-like毒株及欧洲型代表毒株LV一致性较低。2.4.2GP5氨基酸变异分析由图2-5，对比XJzx1、XJzx3～13与本试验参考的8株经典毒株发现：共有6段保守区域，分别为45～56、67～75、81～91、129～136、142～150、171～184。通过对比，发现共有5个较为明显的不同位点，分别为：在第9位aaC-PRRSV多为G，而本试验毒株多为C；在第16位aa，C-PRRSV多为S，而本试验毒株多为F；在第35位aa，C-PRRSV多为S，而本试验毒株多为N；在第185位aa，C-PRRSV多为V，而本试验毒株多为A；在第196位aa，C-PRRSV多为Q，而本试验毒株多为R。对比XJzx1、XJzx3～13与本试验参考的8株NA4毒株，发现：共有5段保守区域，45～57、67～75、81～91、103～116、171～184；XJzx1在18个位点与其他20株皆不相同，分别为(氨基酸，位点)：F10、S14、S25、I26、A27、S30、N32、G33、Y38、S39、G58、C66、A98、H101、E164、G170、K191、I192；XJzx4在4个位点与其他20株皆不相同，分别为：E3，13Q、H15、D34；XJzx6在4个位点与其他20株皆不相同，分别为：A21、P28、K33、V75；XJzx7在4个位点与其他20株皆不相同，分别为：：S34、H58、N61、I98；XJzx8在1个位点与其他20株皆不相同，为K44；XJzx9在1个位点与其他20株皆不相同，为S41；XJzx11在2个位点与其他20株皆不相同，分别为：S23、V80；XJzx12在2个位点与其他20株皆不相同，分别为：S16、I151；XJzx13在4个位点与其他12株皆不相同，分别为：K58、N59、T63、C101与其他20个毒株皆不相同。除XJzx1外在较多位点本试验毒株拥有和HP-PRRSV相同的突变，与之前核苷酸和进化树分析结果相对应。对比XJzx1、XJzx3～13与本试验参考的6株NA3毒株(美国MN184A、MN184C、21 北疆地区猪繁殖与呼吸综合征病毒分子流行病学调查及病毒全基因组分析NADC30毒株和我国JL580、HENAN-XINX、HENAN-HEB毒株)，发现：共有短的较少的保守区域，分别为48～56、67～75、105～116、129～136、142～150；本试验12株毒株与6株NA3型拥有太多不同位点，在此不再一一列举，但引起注意的是：XJzx1拥有与XJzx3～13毒株皆不相同的A27、K191和I192位点，但在A27位点与参考的6株NA3型毒株相同，且在K191和I192位点与MN184A、NADC30、JL580、HENAN-XINX、HENAN-HEB毒株相同，推测XJzx1与NA3型毒株在GP5蛋白变异较为类似，可能有相同的功能变化，这也与之前分析的GP5核苷酸和氨基酸序列遗传进化关系相吻合。22 北疆地区猪繁殖与呼吸综合征病毒分子流行病学调查及病毒全基因组分析图2-5PRRSVGP5基因氨基酸序列比对分析Fig.2-5ComparisonoftheGP5aminoacidsequencesofPRRSV23 北疆地区猪繁殖与呼吸综合征病毒分子流行病学调查及病毒全基因组分析2.4.3GP5系统发育树分析利用IQ-Tree软件中的ModelFinder计算核酸替代模型计算，使用PhyML软件绘制系统进化树进行分析，最优树寻找方法的设置为SPR(最费时，但最能反应种的关系),bootstrap分析设置为100次。核苷酸最佳替代模型为GTR+G+I，碱基替代的类别数为4；核苷酸可变位点的比例分别为0.298；氨基酸最佳替代模型为HIVw+G+F，碱基替代的类别数为4；核苷酸可变位点的比例分别为0。分别代入PhyML3.1构建进化图。GP5核苷酸系统进化分析显示：XJzx1毒株与NA2型HK6毒株位于一支，与NA1/3较为临近；XJzx4和XJzx12与NA2型BJ-4、美洲原型VR-2332和疫苗毒株MLVRespPRRS/Repro位于一支，与NA3、NA4型毒株关系较远，显示XJzx4和XJzx12这两株可能与疫苗毒株变异有关；XJzx3、XJzx5～11和XJzx13与我国N4型高致病毒株位于一个大支，与NA1、NA2、NA3型及疫苗毒株关系较远(见2-6)。GP5氨基酸系统进化分析显示：XJzx1毒株与我国NA2型HK6毒株位于一支，与NA3型毒株关系较为临近，但与NA4型、疫苗毒株关系较远；XJzx4和XJzx12与NA2型BJ-4、美洲原型VR-2332和疫苗毒株MLVRespPRRS/Repro位于一支，与NA3、NA4型毒株关系较远，显示XJzx4和XJzx12这两株可能与疫苗毒株变异有关；XJzx3、XJzx5～11和XJzx13与我国N4型高致病毒株位于一个大支，与NA1、NA2、NA3型及疫苗毒株关系较远(见2-7)。综上数据分析说明XJzx1、XJzx4和XJzx12为NA2型，即C-PRRSV毒株，其中XJzx4和XJzx12这两株可能与弱毒活疫苗疫苗的使用有关；XJzx3、XJzx5～11和XJzx13为N4型，即高致病毒株。24 北疆地区猪繁殖与呼吸综合征病毒分子流行病学调查及病毒全基因组分析图2-6猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5基因核苷酸系统进化分析Fig2-6PhylogeneticanalysisofGP5genenucleotidesequenceofPRRSV注：黑色分支为NA1/2型PRRSV毒株，红色为NADC30-like毒株，蓝色为NA4型HP-PRRSV毒株，绿色为疫苗毒株.图2-7猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5氨基酸序列系统进化分析Fig2-7PhylogeneticanalysisofpartialGP5aminoacidsequencesofPRRSV注：黑色分支为NA1/2型PRRSV毒株，红色为NADC30-like毒株，蓝色为NA4型HP-PRRSV毒株，绿色为疫苗毒株.25 北疆地区猪繁殖与呼吸综合征病毒分子流行病学调查及病毒全基因组分析2.4.4GP5蛋白功能变化分析由图2-5，GP5蛋白第137位氨基酸被认为是区分PRRSV疫苗毒与野毒的一个位点[18]，野毒株为S137，疫苗毒为A137，XJzx1、XJzx3、XJzx5～XJzx11、XJzx13毒株137位氨基酸为S，表明这8株为野毒株，而XJzx4和XJzx12为A137，推测这两株为疫苗毒株，且与前文中GP5核苷酸、氨基酸序列进化树分析结果相对应。GP5氨基酸序列第13和第151位与PRRSV毒力相关[19-20]，强毒株均为精氨酸(R)，弱毒株分别为谷氨酰胺(Q)和甘氨酸(G)，XJzx1株第13和第151位氨基酸分别为H和K，与本试验参考的美洲型高致病、经典毒株皆不相同；XJzx4为Q13和R151，XJzx11和NA3型毒株MN184A、MN184C、NADC30、JL580、HENAN-XINX、HENAN-HEB相同，为R13和K151，XJzx12为R13和I151，推测XJzx4、XJzx11和XJzx12毒性较HP-PRRSV弱。GP5第27～30位氨基酸为诱骗表位[21]，在27位氨基酸XJzx1株与NA1型BJ-4毒株，NA2型JA142、HN1和HK6毒株，6株本试验参考的NA3型毒株均为A，与HP-PRRSV均为V不同；在29位XJzx4和XJzx12与BJ-4、VR-2332及MLVRespPRRS/Repro毒株相同；在30位氨基酸XJzx1株与HK6株为S，与其他参考毒株均不相同。第37～45位氨基酸为主要中和抗原表位[21]，在此区域本试验12个毒株较为保守，只有XJzx1株与经典毒株HK6一致，为Y38、S39，XJzx8为K44，XJzx9位S41，与其他参考毒株均不相同。第180-197位氨基酸为主要非中和抗原表位[21]，在185位XJzx1、XJzx3、XJzx5～11、XJzx13株与经典毒株HK6株、8株NA4型、6株NA3型及疫苗毒株PrimePac相同均为A，而XJzx4和XJzx12为V，与除HK6外的经典毒株及疫苗毒株MLVRespPRRS/Repro毒株相同都为V；在189、191氨基酸XJzx1株与经典毒株HK6株及6株NA3型毒株均为V、K与其他参考毒株均不相同，在192位，XJzx1与HK6及NA3型NADC30、JL580、HENAN-XINX、HENAN-HEB毒株相同；在196位，XJzx4、XJzx7和XJzx12为Q，与除HK6、HPBEDV、JXA1之外的NA1、NA2、NA3和NA4型毒株相同，均为Q，而XJzx1和XJzx3、XJzx9、XJzx10、XJzx11、XJzx13与HK6相同均为R，XJzx6、XJzx8与高致病毒株HPBEDV和JXA1相同，均为L。3讨论2006年我国南方地区爆发的高致病猪繁殖与呼吸综合征，迅速地蔓延至全国大部分地区，加之2012年在我国南方和北方传播的NDAC-30毒株，给我国养猪业造成了前所未有的危害。新疆地区猪的长期引种、地理条件以及饲养环境改变，可能使PRRSV病毒发生变异，与其他地区PRRSV的致病特点出现差异，本试验通过对本地区PRRSV分子流行病学调查及遗传变异分析，揭示北疆地区PRRSV毒株流行情况及与其他流行26 北疆地区猪繁殖与呼吸综合征病毒分子流行病学调查及病毒全基因组分析毒株的关系状况。3.1PRRSVXJzx1毒株遗传特性及致病性分析通过nsp2和GP5核苷酸和氨基酸序列、系统遗传关系及功能变化分析，显示PRRSVXJzx1毒株具有很多不同以往的遗传进化特征。XJzx1nsp2基因氨基酸序列存在472~476位5个的国内外尚属首次报道氨基酸缺失，为新型PRRSVnsp2缺失型，将XJzx1株与参考的8株NA1/NA2型、6株NA3型及8株NA4型毒株进行核苷酸对比发现，XJzx1株nsp2部分基因、GP5基因与NA2和NA4型毒株相似性较近，其中XJzx1株nsp2部分基因、GP5基因核苷酸序列分别与经典毒株HK13、HK6相似性最高，且其GP5序列与NA3型毒株具有很多相似的特征，例如：XJzx1在遗传进化树上与NA3型6株病毒临近，在A27位点与参考的6株NA3型毒株相同，且GP5蛋白在K191和I192位点与MN184A、NADC30、JL580、HENAN-XINX、HENAN-HEB毒株相同，在192位，XJzx1与NA3型NADC30、JL580、HENAN-XINX、HENAN-HEB毒株相同。XJzx1株GP5蛋白具有20个皆不同于本试验的12株美洲型PRRSV毒株(XJzx3~13)的氨基酸位点，值得注意的是GP5蛋白氨基酸序列第13位和第151位与PRRSV毒力相关，XJzx1株在这2个位点与经典、高致病毒株均不相同，在其他主要氨基酸位点XJzx1株与NA1、NA2及NA3型毒株均有相同之处。系统进化树显示，PRRSVXJzx1株，nsp2部分基因、GP5基因分别与NA2型毒株临近。PRRSV经典毒株HB-2(sh)/2002在nsp2基因471~482位点12个氨基酸连续缺失[108]，不在BJ-4株鉴定出的2个线性表位区域内，匡宇等研究发现猪感染HB-2(sh)/2002株后，排出的病毒直接来源除巨噬细胞外还有腺上皮细胞，推测可能其nsp2基因12个氨基酸缺失导致某些抗原表位缺失，影响了PRRSV在猪体内的生长[109]。由于HB-2(sh)/2002株nsp2缺失区域覆盖XJzx1株nsp2472~476位5个氨基酸连续缺失区域，推测XJzx1株NA2型变异株，具有部分HB-2(sh)/2002株的特殊遗传特性，但其毒力有待进一步试验确定。3.2PRRSVXJzx2和XJzx12毒株遗传特性及致病性分析XJzx4毒株在其nsp2核苷酸和氨基酸序列分析中与NA4型高致病毒株较为临近，且具有30个不连续氨基酸缺失特征，具有HP-PRRSV毒株的典型特征；但在GP5基因分析显示其具有较多疫苗毒株特征，如GP5核苷酸和氨基酸进化树中皆与疫苗毒株MLVRespPRRS/Repro、PrimePac位于一支，且具有很多与疫苗毒株相同的氨基酸位点，如S137(S为野毒株区分位点)，A29等；与XJzx4类似XJzx12也在GP5核苷酸和氨基酸进化树中与疫苗毒株位于一支，且具有很多与疫苗毒株相同的氨基酸位点，如：XJzx4和XJzx12在A137(A为疫苗毒株)，在13和151位点，XJzx4为Q13和R151而XJzx1227 北疆地区猪繁殖与呼吸综合征病毒分子流行病学调查及病毒全基因组分析为R13和I151(强毒株均为R)等。故推测存在两种可能：(1).XJzx4和XJzx12为疫苗毒株与HP-PRRSV的重组毒株，既保持HP-PRRSVnsp2的典型缺失，又具有疫苗株GP5蛋白的特征；(2).XJzx4和XJzx12对应的两份阳性样本均含有两种致病性截然不同的毒株，为C-PRRSV和HP-PRRSV。3.2PRRSVXJzx3、XJzx5～11、XJzx13毒株遗传特性及致病性分析PRRSVXJzx3、XJzx5～11、XJzx13这9株具有NA4型高致病毒株30个不连续氨基酸缺失，且遗传进化分析中皆与NA4型毒株关系较近，其GP5氨基酸137位点均为S，故推测这9株均为NA4型高致病毒株，推测为HP-PRRSV毒株。3.3总结综上，本试验采集的100份样品中PRRSV阳性率为33%。随机抽取的13份样品中，XJzx1为C-PRRSV变异株；XJzx4和XJzx12为疫苗株与HP-PRRSV重组株，或为疫苗毒株与HP-PRRSV毒株共同感染样品；XJzx2～3、XJzx5～11、XJzx13这10株为HP-PRRSV毒株。虽然，目前新疆地区尚未有NADC30-like毒株发现，但北疆地区的PRRSV流行情况不容乐观，本试验发现的经典毒株XJzx1具有独特的nsp2缺失及遗传进化特征，推测是由于本地毒株变异与重组导致，更加详细的特征需要进一步研究确定。此外，根据试验中nsp2核苷酸序列比对和序列分析，表明其他地区的PRRSV检测诊断RT-PCR方法并不完全适合本地毒株。新疆地区猪场目前处于PRRSVNA1、NA2和NA4型毒株共存，且NA4高致病毒株呈蔓延趋势，给本地区猪业生产为带来严重的挑战，迫切需要一种适合本地区的RT-PCR诊断方法，同时PRRSV的不断进化，提示需要持续的对其进行跟踪深入研究，为新疆地区的PRRS防控及疫苗使用提供更多的理论依据。28 北疆地区猪繁殖与呼吸综合征病毒分子流行病学调查及病毒全基因组分析试验二PRRSV新疆变异株XJzx1的分离及全基因序列分析摘要：为掌握北疆地区PRRSV遗传变异情况，对本研究中发现的具有独特进化特征的PRRSVXJzx1株进一步分析。利用Marc-145/PAM细胞对XJzx1毒株进行分离鉴定，根据Genbank上公布的与其一致性较高的毒株基因序列设计引物进行全基因扩增和测序，利用生物信息学软件进行一致性、遗传进化及基因重组分析。结果显示，新疆新变异株XJzx1与国内HP-PRRSV和NADC30-like毒株亲缘关系较远，与NA1/NA2型PRRSV亲缘关系较近。基因重组分析显示，XJzx1株很可能是由国内BJ-4和QYYZ毒株重组产生。综上，XJzx1株为我国经典变异重组PRRSV毒株。关键词：PRRSV；分离；最大似然法；全基因组分析在我国，根据PRRSV流行20多年的历程可大致分为三个阶段：第一阶段，NA1和NA2型PRRSV毒株流行期。胡启文等对我国21个省市1996-2000年间PRRS流行状况进行调查发现，521个猪场22144头份血清中PRRSV阳性率为35.85%，阳性猪场率为61.68%。第二阶段，为HP-PRRSV爆发时期。2006年我国爆发由HP-PRRSV引起的HP-PRRS，随着NA4型PRRSV的迅速蔓延，NA1和NA2型PRRSV也被迅速取代，经研究发现HP-PRRSV由PRRSV变异而来，临床主要表现为40-42℃高热症，在短时间内波及我国20多个省份，其中长江流域的省份疫情相对比较严重，感染超过200万头猪，造成40万头猪死亡。第三阶段，为多基因型PRRSV稳定流行期。2012年，周峰等在我国河南首次检测到NADC-30like毒株(NA4型)。至此，在我国PRRSV正处于以NA1、NA2、NA3、NA4型等美洲型毒株为主，欧洲型为次的多基因型PRRSV稳定流行期，同时弱毒活疫苗疫苗的使用共同导致我国PRRS防控工作面临严峻的挑战。自2007年PRRSV灭活疫苗、弱毒活疫苗的使用，疫情得到了有效控制，但仍有点状和区域性爆发PRRS疫情，呈现点状散发和隐性感染状态。PRRSV具有极高频率的变异和基因重组特点，持续快速的进化导致毒株的多样性增加，进一步加剧了防控难度，因此国内大部分地区对PRRSV进行了持续不断的全基因序列分析。在新疆地区，2008~2014年年苏贵成、马伟、张美玲等对分离的XJ-a、XJ-b、XJ-c、XJPRRSV1/03等分离株进行部分基因分析，但自2003年马伟等证实新疆地区存在PRRSV以来，尚未有本地区毒株的全基因分析报道。因此，为进一步分析新疆地区PRRSV流行状况，本试验对nsp2和GP5基因具有独特进化特征的XJzx1毒株进行病毒分离，同时通过全基因测序分析，与国内外毒株对比，从全基因组层面明确其遗传进化特征，更好的为新疆地区PRRS的防控提供理论依据。29 北疆地区猪繁殖与呼吸综合征病毒分子流行病学调查及病毒全基因组分析1材料与方法1.1材料PRRSV阳性病料采自新疆石河子某猪场。胎牛血清FBS、DMEM培养基购自Gibco公司；猪繁殖与呼吸综合征ELISA试剂盒购自武汉科前生物公司；PBS缓冲液、100X青霉素-链霉素(Penicillin-Streptomycin,PS)溶液购自生工生物工程(上海)股份有限公司；TRIzol试剂购自Invitrogen公司；ReverseTranscriptionSystem试剂盒、pGEM-TEasyVector试剂盒购自Promega公司；LATaqDNA聚合酶、MarkerIII、dNTP琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒、pLB零背景快速连接试剂盒和质粒小提试剂盒均购自天根生化科技有限公司；Ampicillinsodiumsalt购自Biosharp公司；氯仿、无水乙醇、异丙醇等为国产分析纯试剂。1.2试验动物及细胞Marc-145细胞为新疆畜牧科学院兽医研究所馈赠；PRRSV阴性猪1头购自石河子某猪场。30 北疆地区猪繁殖与呼吸综合征病毒分子流行病学调查及病毒全基因组分析1.3方法1.3.1引物设计根据PRRSVXJzx1株nsp2部分基因及GP5基因BLAST比对结果，选择与XJzx1一致性最高的毒株HK13(KF287140)为参考，利用PrimerPremier5设计9对扩增PRRSVXJzx1株全基因引物(见表3-1)。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。表2-4扩增PRRSV全基因组引物表2-4Primersforgeneratingthefull-lengthgenomeofPRRSV目的基因引物名称引物序列(5'-3')位置长度F1ATGACGTATAGGTGTTGGCTCTFragmentA1-10571057bpR1CATAGCGAATTTCTTTATTCTGF2CCTGAAGGAAACTGCTGGTGFragmentB985-20751090bpR2CGGTTGGTTTCATTCTGACGGF3GCACAAGGGCGGTCCTGGTTFragmentC1779-32391460bpR3GCTGAGCATCTTGGGCGTGTF4GGCAAGTCAGACAACCGAACAFragmentD2229-40501820bpR4ACGCCGAGAAGACCCAGAAAF5GTGGTTATTCTCCAGGTGATTGFragmentE3926-60262100bpR5CCTCCTCCTTGTTTGTTTGATF6GCCTATTGGCTGACATCCTCFragmentF5872-85682696bpR6AAACCTGTTCCCATTTATTCCF7CGGCTTTGAGTTATATGTGCFragmentG8289-102661977bpR7ATTCTTACCAGGACACCAACCF8ACACGCCAACTCACCAGACCAFragmentH10112-127552643bpR8TTCGCAACCACAGCACAACAF9TTGGAAGCAGGTGGTGAGTGFragmentI12436-153942958bpR9TTTAATTTCGGCCGCATGGT1.3.2病毒分离将猪肺脏病料(约0.1g)用含有1×PS的PBS清洗后，剪碎，放入1.5mLEP管中，加入200mL含有1×PS的DMEM培养基，用研磨棒捣碎，-80℃反复冻融(重复3次)，31 北疆地区猪繁殖与呼吸综合征病毒分子流行病学调查及病毒全基因组分析3000r/min离心10min,吸取上清液，用0.22μm滤膜过滤除菌，则进行细胞感染试验或-80℃保存。将30日龄的PRRSV阴性仔猪放血、结扎气管，无菌状态下取其完整肺脏，用含1%PS的0.9%生理盐水冲洗表面，从气管灌入PBS(pH7.2)100mL，轻拍肺脏2min，收集灌洗液，不断重复，直到灌洗液为清亮；50mL无菌离心管收集所有灌洗液，用移液器轻轻反复吹打细胞团，100目不锈钢筛过滤，后2000r/min离心10min，收集细胞，PBS洗涤两次，加入含有10%FBS和1%PS的DMEM，至于37℃CO2培养箱中培养备用。将上述DMEM病毒混合液进行1:5稀释后，接种于Marc-145细胞，在37℃二氧化碳培养箱中培养，每天观察有无细胞病变，若5天后无细胞病变产生，则可继续进行传代2-3代。如果使用Marc-145细胞未能分离到PRRSV，则换为PAM感染，条件同上。1.3.3RNA的提取及RT-PCR转染后的细胞总RNA提取参照TRIzol说明书进行。RNA的反转录反应在40μL体系中进行,包括提取的样品总RNA4μL、5×ReactionBuffer8μL、MgCl2(25mmol/L)8μL、PCRNucleotideMix(10mM)4μL、Oligo(dT)Primer(500μg/mL)2μL、RandomPrimers2μL、RecombinantRNasinRibonucleaseInhibitor2μL、ReverseTranscriptase2μL，用DEPC水补足至40μL。反应程序为42℃水浴2h，75℃5min，4℃冷却5min。得到的cDNA直接用于PCR扩增。1.3.4分离病毒的RT-PCR鉴定取上述感染后的细胞，提取RNA，利用ORF7引物进行RT-PCR鉴定。PCR反应在25μL体系中进行，其中：2×TaqPCRMasterMix12.5μL、ORF7-F/R引物（10μmoL/L）各1μL、cDNA2μL（阴性对照ddH2O2μL），用ddH2O补足至25μL。反应程序为：95℃预变性5min；95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸60s，35个循环；72℃延伸10min，-20℃保存或进行1.0%琼脂糖凝胶电泳PCR产物检测。1.3.5全基因序列扩增PCR反应在50μL体系中进行，其中：LATaq1μL、上下游引物（10μmoL/L）各2μL、10×LAPCRBuffer5μL、dNTPMixture8μL、cDNA4μL（阴性对照ddH2O2μL），用ddH2O补足至50μL。各引物扩增条件如表2-5所示，35个循环，最后72℃延伸10min，使用1.0%琼脂糖进行凝胶电泳或-20℃保存。32 北疆地区猪繁殖与呼吸综合征病毒分子流行病学调查及病毒全基因组分析表2-5扩增PRRSV全基因组各段引物的PCR条件Table2-5Parametersforamplifyingthefull-lengthgenomeofPRRSV目的基因预变性变性退火延伸FragmentA95℃3min95℃30s58℃30s72℃1min30sFragmentB95℃3min95℃30s59℃30s72℃1min30sFragmentC95℃3min95℃30s58℃30s72℃2minFragmentD95℃3min95℃30s58℃30s72℃2minFragmentE95℃3min95℃30s58℃30s72℃2min30sFragmentF95℃3min95℃30s55℃30s72℃3minFragmentG95℃3min95℃30s59℃30s72℃2minFragmentH95℃3min95℃30s57℃30s72℃3minFragmenI95℃3min95℃30s58℃30s72℃3min1.3.6目的基因的克隆和序列测定8段RT-PCR产物(FragmentA～I)经1%琼脂糖凝胶电泳回收纯化后，连接入pLBVector，连接反应在10μL体系中进行，其中：2×ReactionSolution5μL,pLBVector1μL,PCRproduct3μL，T4DNALigase1μL。混匀后短暂离心5s。反应程序为：22℃30min，进行感受态细胞转化或-20℃保存。将连接产物转化至含有100μL感受态细胞的EP管中，再向管中加入900μLLB液体培养基(不含Amp),混匀后37℃振荡培养1h，取100μL涂布于最终浓度为100μg/mLAmp的LB固体筛选平板上，37℃过夜培养，挑取单克隆菌于100μg/mLAmp的LB液体培养基中摇菌，经PCR鉴定为阳性后，由生工生物工程(上海)股份有限公司测序。1.3.7全基因序列分析将测序结果利用DNAMAN进行拼接，与GenBank中PRRSV基因核苷酸序列比对，选取各型国内外代表毒株及疫苗毒株共计64株，包括：欧洲型代表毒株Lelystadvirus(LV)，各型美洲型毒株(NA1、NA2、NA3、NA4)，疫苗毒株MLVRespPRRS/Repro、PrimePac及本试验毒株XJzx1(表2-6)。使用DNAMAN7推导基因氨基酸序列，ClustalX2进行基因序列比对和数据转化，DNAStarMegAlin进行序列一致性分析，利用IQ-Tree软件中的ModelFinder计算核酸替代模型计算，使用PhyML3.1软件绘制系统进化树进行分析[106-107]，使用FigTreev1.4.3进行进化树修饰(Java运行环境)，最后使用重组检测软件RecombinationDetectionProgram(RDP)和SimPlot软件重组事件并检验结果是否一致。33 北疆地区猪繁殖与呼吸综合征病毒分子流行病学调查及病毒全基因组分析表2-6本试验参考的PRRSV基因序列Table2-6Sequencesusedinthisstydy毒株GenBank登录登录时间来源毒株GenBank登录登录时间来源号号CH-1aAY0326261996中国QYYZJQ3087982011中国BJ-4AF3318312000中国10-10FUJ-2JQ6635472012中国HB-1(sh)/2002AY1503122002中国GM2JN6624242012中国HB-2(sh)/2002AY2623522002中国SDA3JX8783802012中国HN1AY4576352003中国HVJX3176482012中国HUN4EF63500612006中国DCJF7487182012中国JXA1EF1124452006中国WUH4JQ3262712012中国HEB1EF1124472006中国11SH-GDJX2353652013中国HUB1EF0759452006中国GX1003JX9122492013中国HuNEF5179622007中国GX1002JQ9556582013中国HPBEDVEU2362592007中国WUH3HM8536732013中国Henan-1EU2009622007中国SRV07JX5129102013中国SHHEU1068882007中国JXA1-P150KC4227302013中国GDEU1095032007中国JXA1-P140KC4227292013中国07HENFJ3934572008中国HZ-31-HPKC4451382013中国HB-1/3.9EU3601302008中国HK13KF2871402013中国07NMFJ3934562008中国HK6KF2871352014中国08SDWFGU1685692009中国Henan-A14KJ8199362014中国CWZ-1-F3FJ8891302009中国Henan-A6KJ5345412014中国CBB-1-F3FJ8891292009中国SH1211KF6784342014中国HN2007EU8804372009中国HENAN-HEBKJ1436212014中国JXA1-P15FJ5488552009中国JL580KR7063432015中国GD2007EU8804332009中国HENAN-XINXKF6119052015中国NB/04FJ5361652009中国XJzx1KX6892332015中国YDJF7487172009中国JA142AY4242712004美国SX2009FJ8953292009中国PrimePacDQ779791.12006美国HN-HWFJ7976902010中国VR-2332U873921992美国MLV09SDJF2686782011中国AF159149.11998美国RespPRRS/ReproHLM-09HQ8431792011中国MN184ADQ1760192006美国HLJ-09HQ8431782011中国MN184CEF4887392008美国Shaanxi-2HQ4012822011中国NADC30JN6544592012美国JXwn06-81cHQ2336042011中国LelystadvirusM962621991欧洲34 北疆地区猪繁殖与呼吸综合征病毒分子流行病学调查及病毒全基因组分析2结果与分析2.1病毒的分离将病料提取液接种于Marc-145细胞，连续传3代后，未见明显细胞病变；提取细胞RNA，进行RT-PCR鉴定为阴性。后接种于PAM细胞，培养5天后，RT-PCR鉴定为阳性，但未见明显细胞病变；同时收集细胞，储存于-80℃备用。2.2XJzx1株全基因分析2.2.1全基因拼接结果使用DNAMAN进行拼接，获得XJzx1株15388bp全长基因组(不含polyA尾)。根据病毒基因组规律，推测各部分组成，包括UTR、非结构蛋白区域和结构蛋白区域，其中5’UTR和3’UTR分别为187nt、154nt；ORF1区域为188nt~12054nt，总长度为11867nt，分为ORF1a和ORF1b；非结构蛋白编码区域ORF1a区域为188nt~7685nt，长度为7496nt，分为nsp1~nsp8区域，长度分别为：1146nt、3573nt、693nt、612nt、510nt、48nt、776nt、138nt，包含区域分别为：188nt~1333nt、1334nt~4906nt、4907nt~5599nt、5600nt~6211nt、6212nt~6721nt、6722nt~6769nt、6770nt~7546nt、7547nt~7684nt；ORF1b区域为7681nt~12054nt，长度为4374nt，分为nsp9~nsp12，长度分别为：1920nt、1323nt、1991nt、462nt，包含区域分别为：7681nt~9600nt、9601nt~10923nt、9602nt~11592nt、11593nt~12054nt；结构蛋白编码区域分为ORF2a、ORF2b-ORF7，编码GP2a、E、GP3、GP4、GP5、M、N蛋白，长度分别为：795nt、221nt、765nt、537nt、603nt、525nt、372nt，包含区域分别为：12056nt~12820nt、12061nt~12282nt、12673nt~13437nt、13218nt~13754nt、13765nt~14367nt、14352nt~14876nt、14866nt~15237nt。2.2.2Genbank序列比对经BLAST比对XJzx1各部分基因核苷酸序列，记录并整理与XJzx1全基因、各部分基因一致性最高的毒株及其一致性(表2-6)，发现XJzx1基因与目前国内外毒株具有极大的差异性，其中差异最明显的为nsp2基因，最高一致性仅为90%，其次为nsp5(91%)、ORF2a(92%)、ORF3(92%)、ORF4(92%)，将序列提交至GenBank，获得序列登录号为KX689233。35 北疆地区猪繁殖与呼吸综合征病毒分子流行病学调查及病毒全基因组分析表2-7XJzx1最高核苷酸序列一致性BLAST比对表2-7ThehighestnucleotideidentitiesofXJzx1comparedwiththeGenbank序列毒株一致性序列毒株一致性序列毒株一致性序列毒株一致性5’UTRWUHI98%nsp1HB-1/3.9c93%nsp2NB/0490%nsp3HK1394%nsp4HK1395%ORF1aHB-1/3.9c92%nsp5GD391%nsp6SXF10598%ORF1HK1393%nsp7HK1394%nsp810HN-GD97%nsp9HK195%全基HK1392%nsp10HK1395%因ORF1bHK1394%nsp11HK1394%nsp12HK1395%ORF2aHK1592%ORF2bSH/CH/201696%ORF3HK1592%ORF4HNyc1592%ORF5GD-KP93%ORF6GD140494%ORF7GD140494%3’UTRSD2398397%注：WUHI(EU187484)、HK15(KF287142)、SH/CH/2016(KY495781)、HNyc15(KT945018)、GD-KP(KU978619)、GD1404(MF124329)、SD23983(JX258843)、GD3(GU269541)、SXF105(KY373218)、10HN-GD(JX192632)、HK1(KF287132)、HNHK1(KY488475)2.2.3核苷酸序列一致性及系统进化分析使用DNAStarMegAlin的ClustalW对序列进行整理和比对，选取NA1～NA4型美洲型VR-2332、CH-1a、BJ-4、HK13、NB/04、QYYZ、HUN4、JXA1、JL580、HENAN-XINX，和欧洲型LV代表毒株与XJzx1株全基因序列进行一致性比对。如表2-8所示，全基因一致性从高到低分别为：NB/04(91.4%)、HK13(91.3%)、HUN4(90.5%)、CH-1a(90.3%)、36 北疆地区猪繁殖与呼吸综合征病毒分子流行病学调查及病毒全基因组分析VR-2332(86.7%)、BJ-4(86.6%)、JXA1(85.5%)、QYYZ(85.5%)、JL580(82.0%)、HENAN-XINX(80.9%)、LV(58%)。与XJzx1株5’UTR、ORF1a、ORF1b、ORF2a、ORF2b、ORF3、ORF4、ORF5、ORF6、ORF7、3’UTR基因序列一致性最高的分别为：CH-1a(95.2%)、HK13(91.9%)、HK13(94.2%)、QYYZ(92.5%)、QYYZ(95.9%)、VR-2332(87.6%)、BJ-4(97.9%)、QYYZ(92.9%)、QYYZ(93.7%)、QYYZ(93.7%)、BJ-4(96.2%)。通过ClustalX对63株美洲型本试验参考毒株全基因核苷酸序列比对，利用ModelFinder计算最佳替代为GTR+F+I+G4，根据AIC标准的碱基替代模型为A-C:1.1639、A-G:10.3436、A-T:1.4496、C-G:0.4355、C-T:13.0085、G-T:1.0000；碱基替代的类别数为6；可变位点的比例为0.3297。代入PhyML3.1构建进化图(图2-8)。如图，XJzx1毒株与NA2型毒株HB-1(sh)2002、HK13、NB/04、HB-2(sh)2002等NA2型毒株较为临近，与NA3和NA4型毒株较远。图2-8猪繁殖与呼吸综合征病毒全基因组核苷酸序列进化分析Fig.2-8PhylogenetictreeanalysisofPRRSVbasedoncompletegennomicnucleotidesequence注：黑色黄色突出显示的分支为NA3型NADC30-like毒株，绿色为NA1、NA2型及疫苗毒株，红色为XJzx1毒株，37 北疆地区猪繁殖与呼吸综合征病毒分子流行病学调查及病毒全基因组分析蓝色为NA4型HP-PRRSV毒株.2.2.3氨基酸序列一致性及系统进化分析使用DNAStarMegAlin的ClustalW对序列进行整理和比对，如表2-8所示，XJzx1株全基因氨基酸序列(无ORF2b)与上述11株毒株一致性从高到低分别为：HK13(93%)、NB/04(92.6%)、HUN4(92.4%)、JXA1(92.3%)、CH-1a(91.5%)、QYYZ(89.1)、VR-2332(88.8%)、BJ-4(88.6%)、JL580(87.5%)、HENAN-XINX(86%)、LV(57.4%)。与XJzx1株ORF1a、ORF1b、ORF2a、ORF2b、ORF3、ORF4、ORF5、ORF6、ORF7氨基酸序列一致性最高的分别为：QYYZ(93.4%)、HK13(97.8%)、QYYZ(93.3%)、QYYZ(95.9%)、NB/04(89.8%)、CH-1a(91.6%)、QYYZ(94.5%)、QYYZ(98.3%)、BJ-4(97.6%)。利用PhyML3.1构建63株本试验参考的美洲型毒株全基因氨基酸序列进化图(图2-9)。如图，XJzx1与NA4型毒株SH1211和HZ-31位于一支，与NB/04、HK13等N型毒株较为临近，与NA3型毒株较远，显示XJzx1与NA2和NA4型毒株均有密切关系。38 北疆地区猪繁殖与呼吸综合征病毒分子流行病学调查及病毒全基因组分析图2-9猪繁殖与呼吸综合征病毒全基因组氨基酸序列进化分析Fig.2-9PhylogenetictreeanalysisofPRRSVbasedoncompletegennomicaminoacidsequences注：黑色黄色突出显示的分支为NA3型NADC30-like毒株，绿色为NA1、NA2型及疫苗毒株，红色为XJzx1毒株，蓝色为NA4型HP-PRRSV毒株.39 北疆地区猪繁殖与呼吸综合征病毒分子流行病学调查及病毒全基因组分析表2-8XJzx1株与参考毒株核苷酸和氨基酸序列比对表2-8NucleotideanddeducedaminoacididentitiesofXJzx1comparedwiththereferencestrains.VR-2332BJ-4CH-1aHK13NB/04QYYZ序列nt/%aa/%nt/%aa/%nt/%aa/%nt/%aa/%nt/%aa/%nt/%aa/%全基因86.788.886.688.690.391.591.39391.492.685.589.15’UTR88.286.195.274.774.793ORF1a84.284.28483.8798991.991.791.991.271.893.4ORF1b89.895.889.895.792.796.894.297.89497.588.596.2ORF2a89.390.288.989.888.989.489.38989.288.292.593.3ORF2b92.893.292.391.891.98992.391.892.391.895.995.9ORF387.688.687.58986.488.286.188.686.489.886.886.6ORF488.389.997.989.388.191.687918790.488.191ORF583.18282.98284.683.583.48282.68092.994.5ORF692.29692.29690.996.690.19690.396.693.798.3ORF792.297.692.297.690.995.990.195.990.395.993.795.93’UTR96.296.291.791.790.992.5序列HUN4JXA1JL580HENAN-XINXLVnt/%aa/%nt/%aa/%nt/%aa/%nt/%aa/%nt/%aa/%全基因90.592.485.592.38287.580.9865857.45’UTR94.794.790.48444ORF1a91.490.991.290.882.482.680.180.351.947.9ORF1b93.597.393.697.285.197.485.394.263.268.9ORF2a89.288.689.28986.88785.588.666.163.6ORF2b92.391.892.391.890.591.891.491.874.275.7ORF38687.485.88784.68784.183.564.858.9ORF487.391.686.289.385.388.284.985.468.968ORF583.18283.18285.48584.184.562.856.1ORF690.196.690.196.689.793.189.993.170.379.2ORF790.194.390.194.389.791.989.992.770.364.23’UTR91.791.792.591.769.540 北疆地区猪繁殖与呼吸综合征病毒分子流行病学调查及病毒全基因组分析2.3XJzx1株基因重组分析使用重组检测软件RecombinationDetectionProgram(RDP)的CHIMAERA、BOOTSCAN、SISCAN三种计算模式，代入整理完整的所有本实验参考的美洲型毒株(63株)序列，进行重组事件检测，并利用SimPlot软件检验结果是否一致。结果显示XJzx1株可能由BJ-4、HN-HW、QYYZ重组而来，重组位点为12097、15061，这两个重组位点分别位于XJzx1ORF2、ORF7内；将XJzx1基因组分为3部分，其中1-12096nt区域与HN-HW关系较近，12097-15060nt区域与QYYZ关系较近，15061～15388nt区域与BJ-4关系较近。图2-10PRRSVXJzx1株全基因重组分析Fig.2-10RecombinationanalysisofXJzx1withotherreferencePRRSVstrains注：黄色为HN-HW毒株，红色为QYYZ，墨蓝色为BJ-4株.3讨论PRRSV在我国已经历了20余年的流行与变异，其高频率的碱基突变、基因缺失和基因重组在病毒进化演变过程中扮演非常重要的作用。NA-PRRSV可分为NA1～NA4亚型。美洲型原型VR-2332和我国分离株BJ-4毒株为NA1型代表毒株；1996年，我国第一个分离株CH-1a和第一个nsp2基因缺失株HB-2(sh)/2002属于NA2型，1996年我国爆发的HP-PRRSV为NA4型，代表毒株为JXA1和HUN4；2012年我国发现的NADC30-like毒株为NA3型，代表毒株为HENAN-XINX和JL580。NA1和NA2型统称为经典PRRSV毒株，在我国所有地区均有分布，而HP-PRRSV除西藏尚未发现，外其他地区均有报道，NADC30-like在我国河南、吉林等省份均有报道，且呈蔓延趋势。41 北疆地区猪繁殖与呼吸综合征病毒分子流行病学调查及病毒全基因组分析3.1PRRSVXJzx1一致性比对分析核苷酸和氨基酸系统进化分析显示XJzx1毒株与NA2型毒株NB/04、HK13、HB-2(sh)2002等毒株较为临近。此外值得注意的是，该毒株是目前发现的基因位点突变频率最高的毒株，根据BLAST比对显示，目前国内外尚未有与XJzx1核苷酸序列一致性超过95%的毒株报道。根据本试验分析显示，XJzx1毒株基因组各部分均发生了较大位点突变，最为突出的是非结构蛋白nsp2区域。3.2PRRSVXJzx1重组分析核苷酸和氨基酸序列一致性分析显示其非结构蛋白区域与经典毒株HK13一致性较高，其结构蛋白区域与2012年发现的QYYZ(nsp2蛋白有36个连续aa插入)一致性较高，而其ORF7和3’UTR区域与经典毒株BJ-4一致性较高。基因重组分析显示，XJzx1株由BJ-4、HN-HW、QYYZ重组而来，其中1～12096nt区域与HN-HW毒株关系较近，12097～15060nt区域与QYYZ关系较近，15061～15388nt区域与BJ-4关系较近。PRRSVHN-HW毒株分离自湖南省，具有HP-PRRSV的30aa典型缺失，为高致病毒株；GM2和QYYZ株广东省分离自广州，这两株病毒是我国发现的较早的重组毒株，典型特征是其nsp2基因36个连续氨基酸的插入，在我国广为传播，该亚群毒株被称为QYYZ-like毒株，但其确切致病性目前尚未有报道。虽然，基因重组结果显示XJzx1株由HN-HW重组而来，但系统发育树显示两者遗传距离较远，故结合一致性分析、系统发育树和基因重组检测，推测XJzx1由QYYZ和BJ-4重组产生。3.3总结在自然选择及免疫压力的双重作用下，基因变异和重组有助于病毒复制能力的提升，能更快适应宿主。综上数据分析，本试验测定的PRRSVXJzx1毒株具有大量的碱基突变，较少部分的基因缺失和基因重组。推测XJzx1毒株为NA2型PRRSV毒株，是由传入北疆地区的BJ-4、HB-2(sh)/2002、QYYZ等毒株，在当地特殊的环境压力选择下发生了大量突变和少量重组进化而来。虽然目前尚未在北疆地区发现NADC30-like毒株，但XJzx1毒株的分析表明，本地区PRRS的防控形势依然严峻，不容乐观，需要加强本地区PRRSV遗传变异研究，及时掌握当地PRRSV流行特征，才能更好地为疫情预警、疫苗研发、制定合适的防控措施提供理论依据和指导。42 北疆地区猪繁殖与呼吸综合征病毒分子流行病学调查及病毒全基因组分析试验三北疆地区高致病性与经典PRRSVRT-PCR鉴别诊断方法的建立与应用摘要：旨在建立一种快速的可鉴别诊断北疆地区C-/HP-PRRSVRT-PCR方法，并进行分子流行病学分析。根据本实验中测序所得及GenBank中具有代表性的PRRSVnsp2基因序列，在nsp2基因缺失区域两端选择比较保守的区域设计一对特异性引物，通过区分不同长度的RT-PCR产物来鉴定毒株致病性，并进行反应条件优化和特异性、敏感性和重复性测定。结果显示本试验设计的引物扩增HP-PRRSV时得到394bp的片段，而扩增C-PRRSV时得到484bp，最低检测量为30个拷贝，且对猪圆环病毒2型、猪伪狂犬病病毒、猪肺炎支原体均无非特异性扩增。采用该方法对临床100份样本进行三次重复检测，并与ORF7扩增结果和随机选取的10份PRRSVnsp2测序结果进行对比。显示100份样品中，PRRSV阳性为33份，其中C-/HP-PRRSV分别为6份/27例，检出率和重复率均为100%。由此推断，本研究建立的PRRSVRT-PCR鉴别诊断方法具有简单、特意、灵敏、重复性高等优点，能准确鉴别本地区的HP-PRRSV与C-PRRSV，为今后北疆地区的PRRS的防控及流行病学分析提供了重要的技术手段。关键词：猪繁殖与呼吸综合征病毒；RT-PCR；鉴别诊断猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus，PRRSV)是造成猪呼吸道疾病综合征和猪繁殖障碍性疾病的重要病原主要病原之一[110]，并且PRRSV可不同程度的损伤免疫系统，降低机体免疫力[94]，以易继发感染猪伪狂犬病病毒(porcinepseudorabiesvirus,PRV)、猪肺炎支原体(Mycoplasmahyopneumoniae，Mh)、猪圆环病毒2型(porcinecircovirustype2，PCV2)等病原混合感染，并且PRRSV、PCV2、PRV这几种病原可不同程度的损伤免疫系统，降低机体免疫力，从而加剧继发感染的危害，给临床诊断带来极大困难。因此，在PRRSV研究领域内建立快捷、简单、灵敏的病毒诊断方法一直是热门研究之一。目前用于PRRSV诊断的方法主要为病原学和血清学途径。病原学方法主要包括：病毒分离与鉴定、RT-PCR等方法；血清学方法主要包括：酶联免疫吸附试验、间接免疫荧光试验、免疫过氧化物酶单层细胞试验和胶体金免疫层析法等。病原分离与鉴定是最可靠的诊断方法，但其耗时较长的先天因素已经决定这种方法不适合临床快速诊断操作，而血清学诊断方法因其低成本、快速、操作简单、特异性强和灵敏度高等优点一直是猪群PRRSV抗体水平检测评估的重要方法，在实际生产中得到广泛应用，但随着近20年PRRSV不断变异，特别是2006年爆发的HP-PRRSV，使得可快速区分C-PRRSV、HP-PRRSV、NADC30-like、疫苗株等的RT-PCR方法得到广泛推广，具有极高的临床应用价值。43 北疆地区猪繁殖与呼吸综合征病毒分子流行病学调查及病毒全基因组分析随着近20年PRRSV不断变异，特别是2006年爆发的HP-PRRSV，使得在所有检测方法中可快速区分C-PRRSV、HP-PRRSV、NADC30-like、疫苗株等的RT-PCR方法得到广泛推广和应用。常规的RT-PCR是目前应用最广的PRRSV病原检测方法，主要包括RT-PCR、实时定量RT-PCR、实时荧光定量RT-PCR，这些方法主要根据核苷酸序列较为保守的M/N蛋白基因设计；2008年我国制定了以扩增保守基因ORF7的PRRSVRT-PCR诊断方法(GBT18090-2008)。由于NA3和NA4PRRSV具有独特的nsp2缺失，近年来，国内外学者建立了很多基于此原理的PRRSVRT-PCR诊断方法，赫晓芳等根据HP-PRRSV设计的PRRSV区分诊断RT-PCR方法对病原检测，利用高致病毒株30aa的典型缺失，在缺失区域两端设计引物，可同时扩增HP-PRRSV(230bp)和C-PRRSV(320bp)，且易于区分，最小量为10TCID50[95]，周峰等利用NADC30-like毒株131aa的缺失特征，设计特异性的可区分HP-PRRSV和NADC30-like毒株引物，对这两型毒株扩增的长度分别为1120bp和1513bp[96]。张硕建立的荧光定量RT-PCR方法，能特异性的检测在我国流行的所有EU-PRRSV和NA-PRRSV毒株，检测下限分别为22copies/uL和22copies/uL[97]；根据NA1/2和NA4型PRRSV30aa(90nt)差异，2011年我国制定新的可区分PRRSV致病性的RT-PCR方法(GBT27517-2011)。由于PRRSVnsp2基因的高突变性，各地区的毒株均具有独特的遗传进化特征，故在实际临床检测中大多以ORF7基因RT-PCR扩增结果判断PRRSV阳性/阴性，同时利用具有各地区PRRSV序列特点的nsp2扩增引物进行致病性判断。本研究发现我国其他地区的PRRSV致病性区分RT-PCR诊断方法并不能充分检测本地区PRRSV，且目前尚未有新疆地区PRRSVRT-PCR区分诊断方法的建立，故为从根源上进行疾病的防控，迫切需要一种及时准确的鉴别诊断检测方法。1材料与方法1.1材料试验用100份疑似PRRS猪肺脏、脾脏、肾脏、淋巴结组织均采集自石河子、乌鲁木齐、昌吉、伊犁等北疆地区。猪伪狂犬病病毒(porcinepseudorabiesvirus,PRV)、猪肺炎支原体(Mycoplasmahyopneumoniae，Mh)、猪圆环病毒2型(porcinecircovirustype2，PCV2)毒株和大肠杆菌(Escherichiacoli，E.coli)DH5α感受态均由石河子大学动物科技学院基础兽医学实验室保存。TRIzol试剂购自Invitrogen公司；ReverseTranscriptionSystem试剂盒、pGEM-TEasyVector试剂盒购自Promega公司；2×TaqPCRMasterMix、DNAMarkerⅠ、琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒均购自天根生化科技有限公司；Ampicillinsodiumsalt购自Biosharp公司；氯仿、无水乙醇、异丙醇等为国产分析纯试剂。44 北疆地区猪繁殖与呼吸综合征病毒分子流行病学调查及病毒全基因组分析1.2方法1.2.1引物的合成根据本研究所得的PRRSV(XJzx1～XJzx1)nsp2基因序列，设计一对包含HP-PRRSV典型缺失区域的可同时扩增C-/HP-PRRSV的含有简并碱基的特异性引物，同时合成ORF7-F/R进行PRRSV鉴定(表2-9)。表2-9PRRSVnsp2部分基因和ORF7基因扩增引物Table2-9TheprimersofPRRSVpartialnsp2geneandORF7gene目的基因引物名称引物序列(5'-3')长度C-/HP-FACCCTTCCYGAAAGAGTRAGnsp2394/484bpC-/HP-RGTGAGGAHGCAGACAAATORF7-FGTGGTAAACCTTGTCAAATATGCCAN(ORF7)424bpORF7-RCTAACACTGAGGTGCCCAAAGAATAC1.2.2样品总RNA的提取100份病样组织RNA提取参照TRIzol说明书进行。将提取的总RNA储存于-80℃。1.2.3cDNA模板的制备反应在20μL体系中进行，包括提取的样品总RNA2μL、5×ReactionBuffer4μL、MgCl2(25mmol/L)2μL、PCRNucleotideMix(10mmol/L)2μL、Oligo(dT)Primer(500μg/mL)1μL、RandomPrimers1μL、RecombinantRNasinRibonucleaseInhibitor1μL、ReverseTranscriptase1μL，用DEPC水补至20μL，42℃水浴1h，95℃5min，4℃冷却5min。反转录产物于-20℃保存。1.2.4PCR反应条件优化依次对调整影响RT-PCR结果的退火温度、引物浓度、退火时间、延伸时间进行优化，在25μL体系中进行，2×PCRMix12.5μL，退火温度分11个梯度，分别为45.8、46.3、47.1、48.1、48.8、49.6、50.2、51.6、52.2、53.3及54.2℃；上、下游引物最终浓度分7个梯度，分别为0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6及0.8μmol/L；退火时间分4个梯度，分别为30、40、50及60s；延伸时间分2个梯度，分别为30和60s。45 北疆地区猪繁殖与呼吸综合征病毒分子流行病学调查及病毒全基因组分析1.2.5重组质粒的构建及测序PRRSVnsp2部分基因目的基因与pGEMT-easy载体连接、转化、挑菌、摇菌，按照试剂盒说明书提取质粒，经PCR鉴定后，送往华大基因进行测序。1.2.6敏感性试验对PRRSV-nsp2载体模板分别进行5倍稀释，分11个梯度，最初模板浓度为5ng/μL，即从50至5-10ng/μL，根据公式(6.02×1023次拷贝数/moL)×(浓度g/mL)/(MWg/mol)=拷贝/mL，进行拷贝数计算，以检验RT-PCR反应的敏感性。1.2.7特异性试验以相同条件加入E.coli、PRV、Mh、PCV2毒株DNA，进行扩增，验证所建立方法的特异性。1.2.8一致性检测利用PRRSVORF7-F/R进行PRRSV鉴定。利用C-/HP-F和C-/HP-R进行PRRSV鉴定，对RT-PCR产物进行测序。100份临床病样重复3次RT-PCR检测，记录数据，对比每次检验的结果是否对应一致。2结果与分析2.1PCR反应条件的优化结果PRRSVRT-PCR最佳反应体系25μL：2×MultiplexPCRMasterMix12.5μL，PRRSV上、下游引物（10μmol/L）各2μL，cDNA2μL，用灭菌双蒸水补至25μL。最佳反应条件：95℃预变性5min；95℃变性30s，52℃退火30s，72℃延伸1min，35个循环；72℃延伸10min；4℃保存。使用2.0%琼脂糖进行凝胶电泳，在RT-PCR反应体系里可扩增出394bp(NA4型PRRSV)和484bp(NA1/NA2型PRRSV)条带，且可清晰分辨出来。2.2PCR产物的测序鉴定本试验扩增的PRRSVnsp2部分基因序列与GenBank中的相关序列比对结果显示，相46 北疆地区猪繁殖与呼吸综合征病毒分子流行病学调查及病毒全基因组分析似性高达99%，显示引物扩增出的目的片段均为PRRSVnsp2基因。2.3敏感性试验提取PRRSV-nsp2基因载体质粒作为模板，进行5倍稀释，分11个浓度梯度，分别为50至5-10ng/μL，进行RT-PCR，以检验反应的敏感性，最初模板浓度为50ng/μL。根据公式(6.02×1023次拷贝数/moL)×(浓度g/mL)/(MWg/mol)=拷贝/mL，结果显示，建立的RT-PCR方法最低检出量均为30个拷贝（图2～6）。图2-11HP-PRRSVRT-PCR的敏感性试验Fig.2-11,SensitivitytestoftheRT-PCRfordetectionofHP-PRRSV0-10M，MarkerⅡ;1～11,5至5ng/μL；12,阴性对照0-10M,MarkerⅡ;1-11,Differentconcentrationsoftemplatefrom5to5ng/μL;12,Negativecontrol图2-12C-PRRSVPCR敏感性试验Fig.2-12SensitivitytestofC-PRRSVM，MarkerⅡ;1～11,50至5-10ng/μL；12,阴性对照M,MarkerⅡ;1-12,DifferentconcentrationsofPRRSVtemplatefrom50to5-10ng/μL;12,Negativecontrol2.4特异性试验分别以E.coli、PRV、Mh、PCV2毒株DNA为模板进行PCR扩增，结果显示均为阴性。47 北疆地区猪繁殖与呼吸综合征病毒分子流行病学调查及病毒全基因组分析表明本试验建立的RT-PCR方法特异性良好。图2-13RT-PCR特异性试验Fig.2-13SpecifictestsofthemultiplexPCRmethodM，MarkerⅠ;1,HP-PRRSVRT-PCR产物；2,C-PRRSVRT-PCR产物;3～6，E.coli、PRV、Mh、PCV2；6，阴性对照M,MarkerⅠ;1,RT-PCRproductofHP-PRRSV;2,C-PCRproductofHP-PRRSV;3-6,E.coli,PRF,Mh,PCV2;6,Negativecontrol2.5临床病料检测结果对100份临床病料，使用PRRSVORF7和C-/HP引物进行RT-PCR扩增，并对10份C-/HP引物扩增产物进行测序比对分析。结果显示，利用PRRSVORF7F/R和C-/HP引物均检测到33份PRRSV阳性样本，结果一致；利用C-/HP引物进一步鉴定PRRSV致病性，结果显示，33份阳性样本中经典/高致病分别为6份/27例；随机选取10份PRRSV阳性病料进行测序分析，结果与使用C-/HP引物RT-PCR鉴别诊断结果一致。部分样品RT-PCR的检测结果见图2-14。对100份临床样品，使用C-/HP引物重复3次进行RT-PCR鉴别诊断，结果均一致。图2-14部分临床组织样品的RT-PCR检测结果Fig.2-14RT-PCRDetectingresultsofpartofclinicalsamplesM，MarkerⅡ；1～11临床样本；12，阴性对照M,MarkerⅡ;1～11,Clinicalsamples;12,Negativecontrol48 北疆地区猪繁殖与呼吸综合征病毒分子流行病学调查及病毒全基因组分析3讨论目前PRRS流行状况越来越复杂，多基因型混合感染也越来越普遍，猪群长期带毒，PRRSV疫情的发生和流行对养猪业的危害日益加重。传统的病原分离、免疫荧光试验和酶联免疫吸附试验是检测猪疫病的重要手段，但这些方法存在着费时费力、敏感性和特异性不高的缺陷，因此，建立一种快速、敏感、简单地诊断方法尤为重要。RT-PCR技术不仅保持了普通PCR技术的敏感性和特异性，还具有简单、快捷、灵敏等优点，是一种非常有效的实验室病原检测技术。国内众多学者，根据当地毒株流行特征，在PRRSVnsp2基因缺失两端选择较为保守的区域，建立了大量的PRRSVRT-PCR鉴别诊断方法，但不同地区的PRRSV毒株具有一定的流行特征，经本研究发现，其他地区学者建立的RT-PCR方法，并不能满足当地PRRSV毒株的鉴别诊断，因此本研究通过对新疆本地区的PRRSVnsp2基因遗传进化研究，进而根据本地基因序列设计特异性引物，由于nsp2基因为高变异基因，故在引物中加入了简并碱基，建立了可同时检测北疆地区HP-PRRSV、C-PRRSVRT-PCR检测方法。使用同一引物扩增不同片段时，为了便于琼脂糖凝胶电泳观察分辨，扩增产物长度相差最好在50bp以上，片段长度在600bp以下，本试验所扩增的目的条带大小分别为394bp(HP-PRRSV)、484bp(C-PRRSV)，相差90bp(HP-PRRSVnsp2蛋白缺失30个氨基酸)，经2.0%琼脂糖凝胶电泳可清晰的在电泳图中进行区分，且特异性较强，对其他猪常见传染病原均无扩增。从临床样本检测中发现目前北疆地区呈经典和高致病PRRSV毒株共存，高致病毒株呈蔓延趋势，在未来应加强HP-PRRSV监测及防制。49 北疆地区猪繁殖与呼吸综合征病毒分子流行病学调查及病毒全基因组分析第三章试验结论1、根据北疆地区PRRSV分子流行病学研究发现，目前本地区呈现高致病毒株不断蔓延的趋势，同时经典毒株不断变异和重组，导致新型毒株层次不断；虽然尚未发现NADC30-like毒株存在，但PRRS防控形势依然严峻。2、遗传进化分析显示，PRRSVXJzx1毒株独特的变异特征是由大量的核苷酸突变和少部分的基因重组共同导致，推测XJzx1为经典毒株重组变异毒株，表明应加强本地区PRRSV的遗传进化研究，以便及时掌握毒株变异情况。3、根据临床检测表明，基于本试验所得数据所建立的PRRSVRT-PCR鉴别诊断方法，能较好的进行本地区PRRSV区分诊断。50 北疆地区猪繁殖与呼吸综合征病毒分子流行病学调查及病毒全基因组分析参考文献[1]MeulenbergJ.J.PRRSV,thevirus[J].Vet.Res.,2000,31(1):11-21.[2]Keffaber,K.K.,Reproductivefailureofunknownetiology[J].AmericanAssociationofSwinePractitioners,1989,1,1–9.[3]郭宝清,陈章水,刘文兴,等.从疑似PRRS流产胎儿分离PRRSV的研究[J].中国畜禽传染病,1996,18(2):1-4.[4]杨汉春,黄芳芳,郭鑫,等.猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)BJ-4株全基因组序列测定与分析[J].农业生物技术学报,2001,9(3):212-218.[5]SusanL.B.,CrystalL.L.,AnnC.V.,etal.Genomicsequenceandvirulencecomparisonoffourtype2porcinereproductiveandrespiratorysyndromevirusstrains[J].Virusresearch,2012,169(1):212-221.[6]周峰,常洪涛,赵军,等.2013-2013年猪繁殖与呼吸综合征病毒河南流行株的分离鉴定及分子流行病学调查[J].中国兽医学报,2014,34(9):1398-1404.[7]ZhaoK.,YeC.,ChangX.B.,etal.ImportationandrecombinationareresponsibleforthelatestemergenceofhighlypathogenicporcinereproductiveandrespiratorysyndromevirusinChina[J].J.Virol.,2015,89(20):10712-10716.[8]TiankG.,YuX.L.,ZhaoT.Z.,etal.EmergenceoffatalPRRSVvariants:unparalleledoutbreaksofatypicalPRRSinChinaandmoleculardissectionoftheuniquehallmark[J].PLoSOne,2007,2(6):526.[9]DunowskaM.,BiggsP.J.,ZhengT.,etal.IdentificationofanovelnidovirusassociatedwithaneurologicaldiseaseoftheAustralianbrushtailpossum(Trichosurusvulpecula)[J].Veterinarymicrobiology,2012,156(3):418-424.[10]BenfieldD.A.,NelsonE.,CollinsJ.E.,etal.Characterizationofswineinfertilityandrespiratorysyndrome(SIRS)virus(isolateATCCVR-2332)[J].J.Vet.Diagn.Investig,1992,4(2):127-133.[11]Nelsen,C.J.,Murtaugh,M.P.,Faaberg,K.S.,Porcinereproductiveandrespira-torysyndromeviruscomparison:divergentevolutionontwocontinents[J].J.Virol.,1999,73(1):270-280.[12]LiuJ.K.,WeiC.H.,YangX.Y.,etal.GeneticdiversityandevolutionarycharacterizationofChineseporcinereproductiveandrespiratorysyndromevirusesbasedonNSP2andORF5[J].ArchivesofVirology,2013,158(8):1811-1816.[13]ShiM.,LamT.T.Y.,HonC.C.,etal.MolecularepidemiologyofPRRSV:aphylogeneticperspective[J].VirusResearch,2010,154(1):7-17.[14]ChenN.,CaoZ.,YuX.,etal.EmergenceofnovelEuropeangenotypeporcinereproductiveandrespiratorysyndromevirusinmainlandChina[J].J.Gen.Virol.,2011,92(4):880-892.[15]SurJ.H.,DosterA.R.,ChristianJ.S.,etal.Porcinereproductiveandrespiratorysyndromevirusreplicatesintesticulargermcells,altersspermatogenesis,andinducesgermcelldeathbyapoptosis[J].JVirol.1997,71:9170-9179[16]KimH.S.,KwangJ.,YoonI.J.,etal.Enhancedreplicationofporcinereproductiveandrespiratorysyndrome(PRRS)virusinahomogeneoussubpopulationofMA-104cellline[J].ArchivesofVirology.1993,133(3-4):477-483.[17]SnijderE.J.,KikkertM.,FangY.,Arterivirusmolecularbiologyandpathogenesis[J].J.Gen.Virol.,2013,94(10):2141-2163.[18]BarcenaM.,OostergetelG.T.,BartelinkW.,etal.Cryo-electrontomographyofmousehepatitisvirus:Insightsintothestructureofthecoronavirion[J].Proc.Natl.Acad.Sci.USA.,2009,106(2):582-587.51 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北疆地区猪繁殖与呼吸综合征病毒分子流行病学调查及病毒全基因组分析致谢本文是在导师盛金良副教授的悉心指导下完成的。导师对论文的选题、实验设计、实施、论文的写作、学习和工作等各个方面都给予我极大的关怀和支持，本篇论文凝聚了导师的无数心血。盛老师渊博的知识，严谨的学术态度，认真负责的敬业精神，坦率宽容、平易近人的处事方式以及敏锐的洞察力和精益求精的科研精神，使我在以后的学习、工作和生活中终生难忘，也必将使我受益终身，在此谨向我尊敬的恩师表示衷心的感谢和崇高的敬意！本研究是在动物科技学院基础兽医学实验室完成的，本院的各位老师和同学在学习上给予我极大的支持和帮助。特别感谢沈文、杨霞、蒋松老师在我学习和生活中给予的悉心指导和关怀。感谢本院各位老师在我完成课程及论文工作中给予的热心帮助和悉心指导！感谢黄林、赵庆亮、张殿清、杨素芳、陈新凯、梁田、肖媛媛、韩国华、刘帅兵、连科讯、孟露萍、张永生、彭叶龙等师哥师姐在我学习研究期间帮我排忧解难，感谢所有帮助过我的2015级同学们!感谢我的家人和朋友一直以来对我无微不至的照顾，关心和帮助！总之，向3年来所有关心和帮助我的人表示深深的谢意！58 北疆地区猪繁殖与呼吸综合征病毒分子流行病学调查及病毒全基因组分析作者简介张勋，男，生于1990年8月，陕西省蓝田县。2015年毕业于石河子大学动物科技学院，动物医学专业。2015年9月起在石河子大学动物科技学院基础兽医学攻读硕士硕士学位，研究方向为动物疾病分子生物学。研究生期间发表的文章:[1]张勋，吴鹏，李世震，伏寅峰，许追，梁田，杨素芳，陈新凯，齐亚银，盛金良.新疆地区4种猪病多重PCR检测方法的建立与初步应用[J].中国畜牧兽医2015,42(10):2612-2618.[2]张勋，赵庆亮，梁田，陈新凯，吴鹏，盛金良.1株NSP2蛋白5个氨基酸缺失的猪繁殖与呼吸综合征病毒遗传进化分析[J].西北农林科技大学学报(自然科学版),2017,45(2):37-43.[3]XunZhang,Jin-LiangSheng,Min-XuanSun.AdvanceandapplicationofDNA-functionalizednanoparticles.CurrentMedicinalChemistry(正审状态).获奖情况：2015年荣获新疆维吾尔族自治区第七届研究生论坛二等奖59 北疆地区猪繁殖与呼吸综合征病毒分子流行病学调查及病毒全基因组分析石河子大学硕士研究生学位论文导师评阅表研究生姓名张勋学制三年专业基础兽医学研究方向动物疾病分子生物学学术评语:指导教师签字:年月日60
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