猪繁殖与呼吸综合征病毒流行株nsp2基因的克隆及序列分析

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1、·48·生物技术中国畜牧兽医2O1O年第37卷第9期猪繁殖与呼吸综合征病毒流行株Nsp2基因的克隆及序列分析闫东明，卢士英，任洪林，周玉，宫彬彬，郑鑫，杜运升。，王光明，柳增善(1．人兽共患病研究教育部重点实验室，吉林大学人兽共患病研究所，畜牧兽医学院，长春130062；2．吉林农业大学动物科学技术学院，长春130118；3．长春康发动物药品研究所，长春130062)摘要：采用RT-PCR方法，从吉林省部分地区猪场的病料中扩增猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的Nsp2基因并测序。应用DNAStar7．0、ClustalX1．83、M

2、EGA4．0软件对测序结果进行分析，并与NCBI上已登录的PRRSV代表毒株的N声2基因进行序列比对，结果显示，得到的Nsp2基因与VR一2332、CH—la等代表毒株的一致性为62．0～87．5，与国内高致病性PRRSV毒株JXA1、HUB2等的一致性为97．8～98．9；氨基酸序列比对结果显示与VR一2332、CH一1a等代表毒株的一致性为34．4～59．0，与国内高致病性PRRSV毒株JXA1、HUB2等的一致性为95．1～98．4。因此，引起吉林省部分地区猪场发生猪繁殖与呼吸综合征的PRRSV与国内流行的高致病性PRRSV毒株亲

3、缘关系较近。关键词：猪繁殖与呼吸综合征病毒；Nsp2基冈；序列分析中图分类号：$852．659．6文献标识码：A文章编号：1671-7236(201O)09—004804猪繁殖与呼吸综合征(porcinereproductiveand2009)，测序分析其核苷酸和氨基酸序列的一致性与respiratorysyndrome，PRRS)是由猪繁殖与呼吸综变异性，进而讨论该地区猪繁殖与呼吸综合征的发合征病毒(porcinereproductiveandrespiratory病原因及流行趋势。syndromevirus，PRRSV)引起的一种传

4、染病，以引l材料与方法起母猪发热、厌食、早产、流产、死胎等繁殖障碍及仔1．1材料猪高死亡率和育成猪呼吸困难、发育迟缓为特征的1．1．1主要试剂和仪器SimplyP总RNA提取试疫病(张青娴等，2008)。PRRSV属于动脉炎病毒剂盒购自BioFlux公司；AxyPrepDNA凝胶回收试科动脉炎病毒属，为不分节段有囊膜的单股正链剂盒购自AXYGEN公司；反转录酶(AMV)、RNA病毒。根据病毒基因组核苷酸序列的不同可RnaseInhibitorrTaqpMD18-TVectordNTPs、将PRRSV分为2个基因型，即北美洲型(VR一DG

5、L2000、BamHI及HindⅢ限制性内切酶等购2332)和欧洲型(LV)(Allende等，1999)。PRRSV自TaKaRa。的基因组全长约15kb，含有9个开放阅读框1．1．2病料猪肾脏、肺脏、肝脏、脾脏、血液等采(ORFs)，顺序依次为5ORFla—ORFlbORF2a—集自吉林省农安、怀德、梨树等地猪场。ORF2b—ORF(3-7)一3(冉智光等，2006)。Nsp2基1．1．3引物引物由哈尔滨兽医研究所提供。上因位于ORF1区，全长约2．9kb，主要编码非结构游引物序列为：5一CGGAAGAAACTGTCGGTG一蛋白，

6、具有种特异性(张林吉等，2007；Shen等，3，下游引物序列为：5，_GGCTCATCCTGGT—2000)。不同毒株基因序列因缺失而长度不一，其编GCGT一3。码氨基酸长度也不同，并且存在较高的变异。1．2方法本研究通过采集吉林省部分地区猪场病料，1．2．1总RNA的提取取病猪的肾脏、肺脏、肝RTPCR扩增PRRSV的Nsp2基因(李金栋等，脏等组织各100mg，剪碎后分别置于不同的无菌研磨器中研磨，然后将组织匀浆移到不同的无RNA收稿日期：201003—22酶的1．5mL离心管中。按照SimplyP总RNA提作者简介：闫东明(19

7、83一)，男，河北人，硕士，研究方向：兽医公取试剂盒的说明书提取总RNA。共卫生。1．2．2病毒cDNA的合成将提取的总RNA反通信作者：柳增善(1959一)，博导，教授。E—mail：zsliul959@转录成cDNA，总反应体系为2OL，具体的反应体163．corn系如下：无RNA酶水10L，10×RTBuffer2L，王光明(1969)，讲师。Email：gmwang@jlu．edu．cn基金项且：吉林省科技发展计划重点项目(20070209)。2．5mmol／L的dNTPs2L，1ug／／~L的OligdT中国畜牧兽医2Ol0年

8、第37卷第9期生物技术·49·1肚L，AMVReversetranscripatase1L，Ribonu—McleaseInhibitor1／,I，总RNA3“I。1．2．3PCR扩增目的片段以合成的eDN