gv143-egfp-ecad和pires2-egfp-ecad两种质粒在腹膜间皮细胞中的表达

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1、万方数据中图分类号＆鱼窆21鱼UDC610学校代码!Q三三三密级公珏硕士学位论文GV143．EGFP—ECAD和IpIRES2．EGFP．ECAD两种质粒在腹膜间皮细胞中的表达DifferentialexpressionofGV143·-EGFP·-ECADandplRES2--EGFP--ECADplasmidsinHMrSV5cells作者姓名：学科专业：研究方向：学院(系、所)：指导老师：副指导老师：陈红临床医学内科学中南大学湘雅三医院张浩教授张柯主治医师答辩委员会主席中南大学2013年5月万方数据学位论文原创性声明。删本人郑重

2、声明，所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了论文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中南大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我共同工作的同志对本研究所作的贡献均已在论文中作了明确的说明。申请学位论文与资料若有不实之处，本人承担一切相关责任。作者签名：睦垒日期：型!垒年』月堕Et学位论文版权使用授权书本学位论文作者和指导教师完全了解中南大学有关保留、使用学位论文的规定：即学校有权保留并向国家有关部门或机构送交学位论文的复印件和电子

3、版；本人允许本学位论文被查阅和借阅；学校可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用复印、缩印或其它手段保存和汇编本学位论文。保密论文待解密后适应本声明。导师签日期：月≯7日万方数据摘要GVl43一EGFP—ECAD禾【IplRES2．EGFP—ECAD两种质粒在腹膜间皮细胞中的表达目的：以GVl43．EGFP。ECAD和plRES2．EGFP．ECAD两种质粒分别转染腹膜间皮细胞，并评估转染效率及E．caherin在腹膜间皮细胞中的过表达。方法：(1)以E．cadherin．pcDNA3为基因模板，plRES2．

4、EGFP、GVl43．EGFP为基因载体，分别构建plRES2．EGFP．ECAD和GVl43．EGFP．ECAD表达载体。将目的基因E．cadherin(ECADE．钙粘蛋白)和基因载体(plRES2．EGFPandGVl43．EGFP)进行双酶切后连接，转化至大肠杆菌DH5a感受态细胞扩增，利用重组体抗性筛选阳性克隆，阳性克隆细胞进行扩增和提取、酶切鉴定、测序验证。(2)采用阳离子脂质体转染法用两种质粒分别转染腹膜间皮细胞株(}玎沁SV5)，质粒转染分组为转染Oh、24h、36h、48h、72h组。(3)在荧光显微镜下观察表达EG

5、FP(增强型绿色荧光蛋白)的细胞数，并计算转染效率(4)HMrSV5细胞株转染后提取各组细胞总RNA，采用RealTimePCR检测各组细胞E．cadherinmRNA的表达水平。采用Westemblot及间接免疫荧光检测各组E．cadherin蛋白的表达水平，及空质粒转染组E．cadherin和0【．SMA的表达水平结果：(1)构建的plRES2．EGFP．ECAD、GVl43．EGFP—ECAD质粒经测序分析证实，质粒序列无突变，经限制性内切酶酶切后电泳鉴定，显示plRES2．EGFP．ECAD2条带分别在2．6K和5．4K的位置

6、，GVl43一EGFP—ECAD电泳结果显示酶切后2条带分别在4．8K、2．6K左右，证明质粒构建成功。(2)以表达EGFP的细胞数评估转染效率，转染GVl43．EGFP．ECAD的细胞仅见36h、48h有少数几个细胞表达EGFP，24h、72h均未见表达。转染plRES2．EGFP．ECAD的细胞提示转染后24h、36h、48h、72h均可见EGFP表达，36h时表达EGFP的细胞最多，计算转染效率分别为：18％、58％、41％、15％。(3)RealTimePCR结果显示：转染两种ECAD质粒后，ECADmRNA表达较上调，24小

7、时达到高峰，36h、48h、72h较24h呈时间依赖性下降，但仍高于0h组。Westernblot结果显示：转染24小时后，分别使用两组质粒Il万方数据转染的腹膜间皮细胞E．cadherin蛋白表达均在24小时即开始升高，36小时达到高峰，48小时、72小时较36小时低，但仍高于空白对照组。空质粒转染组，在转染72h后E．cadherin蛋白表达降低、仅．SMA蛋白表达增高。结论：(1)两种质粒均能使E．cadherin在腹膜间皮细胞中过表达；(2)应用plRES2．EGFP．ECAD转染腹膜间皮细胞能通过EGFP的表达更好的评估转染

8、效率，为进一步实验提供了可靠依据。本文含图12幅，表1个，参考文献33篇。关键词：E一钙粘蛋白腹膜间皮细胞GVl43-EGFP-ECADPIRES2—。EGFP—。ECAD分类号：610万方数据Differentiale