egcg调节p53和egfr信号通路抑制人类肺癌细胞的分子机制研究

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1、万方数据中图分类号——UDC．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．——博士学位论文学校代码!Q5三三密级公珏EGCG调节p53和EGFR信号通路抑制人类肺癌细胞的分子机制研究MolecularmechanismofwhichEpigallocatechingallate‘rdail)itshuman‘ungcancercellsviaregulatingp53mdlnlalItShumanlunlzantrcellsV1aatlnl乏andEGFRsignalpathway作者姓名：学科专业：研究方向：学院

2、(系、所)：指导教师：金龙玉临床医学外科学(心胸外科)湘雅二医院喻风雷教授万方数据博士学位论文原创性声明学位论文原创性声明本人郑重声明，所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了论文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中南大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我共同工作的同志对本研究所作的贡献均已在论文中作了明确的说明。申请学位论文与资料若有不实之处，本人承担一切相关责任。储虢耸吼兰年上月掣日学位论文版权使用授权书本学位论文作者

3、和指导教师完全了解中南大学有关保留、使用学位论文的规定：即学校有权保留并向国家有关部门或机构送交学位论文的复印件和电子版；本人允许本学位论文被查阅和借阅：学校可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用复印、缩印或其它手段保存和汇编本学位论文。保密论文待解密后适应本声明。作者答名．善砷k作者签名：二芝习!∑吼卫年!月粤日导师签名孽丝喻丑年!月孕日万方数据博士学位论文中文摘要摘要背景：肺癌是人类肿瘤的头号杀手，其复发和转移是肺癌患者五年生存率得不到有效改善的主要原因。肿瘤抑制基因的过度失活与癌基因的异常活化在肺

4、癌的发生发展中起着至关重要的作用。超过60％的肺癌中出现了肿瘤抑制基因p53的突变与功能异常；超过25％的肺癌中检测到了原癌基因c．erbBl(EGFR)的扩增。近年来，肿瘤的化学预防日益受到人们的关注，绿茶多酚EGCG是目前已知的最有效的天然抗肿瘤化合物之一。虽然已有研究证实EGCG能活化p53并能抑制EGFR信号通路，但其分子机制还不清楚。鉴于此，有必要对EGCG调节p53及EGFR信号通路抗肺肿瘤的分子机制作进一步研究。目的：首先以p53的翻译后修饰为切入点，通过分析p53蛋白的稳定性、转录活性及其负性调节因子MDM2对p

5、53的降解作用，为EGCG诱导p53蛋白活化的分子机制提供实验依据。接着，以EGFR及其介导的信号转导通路为靶标，从EGFR激酶活性和转录活性入手，分析EGCG在多个层面对EGFR信号通路抑制的分子机制，为EGCG的肺癌预防与潜在的临床治疗应用提供理论依据。方法：首先，通过软琼脂集落形成实验和慢病毒介导的基因沉默技术，确认EGCG抗肺肿瘤的效果部分依赖于p53蛋白活性。接着，利用westernblot、荧光素酶双报告基因实验等方法，从p53蛋白稳定性，胞浆胞核分布及其反式激活能力等方面，证实EGCG诱导p53蛋白的积聚与活化。通

6、过免疫共沉淀分析EGCG对MDM2与p53的结合能力及p53泛素化降解的影响。Westernblot分析EGCG对EGF诱导万方数据博士学位论文中文摘要的EGFR信号通路活化的影响，检测EGCG对EGFR总蛋白、胞膜、胞核表达的影响及其反式激活能力的改变，再应用Westernbid分析EGFR靶基因cyclinDl的表达。最后，流式细胞术分析EGCG对肺癌细胞周期行进的影响。结果：1．Softwar结果表明，EGCG对p53野生型肺癌细胞具有更显著的抑制效果，基因沉默p53表达能增强肺癌细胞对EGCG的耐受能力。2．Westem

7、blot结果显示，EGCG延长p53和MDM2的半衰期，并剂量依赖性上调p53Serl5和Ser20磷酸化及其下游靶基因MDM2和p21的表达，促进p53的核积聚。3．荧光素酶双报告基因实验结果提示，EGCG剂量依赖性上调p53的反式激活能力，差异有统计学意义(p

8、，EGCG剂量依赖性和时间依赖性抑制EGFR的总蛋白、胞膜和胞核表达，并抑制EGFR的下游靶基因cyclinDl的表达。7．EGCG剂量依赖性抑制EGFR的反式激活能力，差异有统计学意义(p