egcg抑制肺癌细胞增殖及其机制的研究

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1、EGCG抑制肺癌细胞增殖及其机制的研究　　【Abstract】AIM:Toexploretheeffectofepigallocatechin3gallate(EGCG)ontheproliferationoflungcancercellsanditsmechanism.METHODS:HumanlungcancercelllineA549RNAandproteing/LEGCG(P<0.01).Theexpressionofsurviving/LEGCG.CONCLUSION:EGCGcaninhibitthegroanlung

2、cancercellsandinducecellapoptosis.Itsmechanismmaybeassociateds;survivin;apoptosis　　【摘要】目的：研究表没食子儿茶素3没食子酸酯(EGCG)对人肺癌细胞增殖的影响及机制.方法：培养肺癌细胞A549，加入EGCG制作细胞抑制曲线；EGCG作用于人肺癌A549细胞株前后通过Hoechst染色检测细胞凋亡.RTPCR及EM培养基(含100mL/L小牛血清,10万U/L青霉素,10万U/L链霉素),在37℃50mL/LCO2培养箱内进行培养.EGCG以无血清DM

3、EM培养基稀释冻存于-20℃.　　1.2方法　　1.2.1细胞毒试验(MTT法)将常规培养的A549细胞用胰蛋白酶消化后制成1×105/L的单细胞悬液，加入96孔细胞培养板中每孔0.2mL，培养24h后，换含不同浓度的EGCG培养液，每浓度设6复孔，培养48h.实验终止前4h每孔加入MTT液(5g/L)20μL，继续培养4h.小心吸去上清液后每孔加入DMSO150μL，在振荡器上轻轻振荡5min后，酶标仪测定各孔的吸光度值(A490nm),按下式计算各用药组的生长抑制率IR(%):生长抑制率IR(%)=(1-用药组平均A490nm/对照组A

4、490nm)×100%.　　1.2.2Hoechst染色EGCG处理48h后的肺癌细胞与对照组细胞制作细胞爬片，用PBS洗3次，40g/L多聚甲醛固定30min，PBS洗3次.吸弃PBS，加入0.5mLHoechst染色液，染色10min,染色时摇动数次.之后吸弃染色液，加一滴抗淬灭液于载玻片上，细胞面朝下轻轻放在载玻片液滴上，荧光显微镜下观察凋亡.　　1.2.3survivinRTPCR将EGCG处理48h后的肺癌细胞与对照组细胞以TRIZOLReagent提取总RNA，紫外分光光度计准确定量，相同条件下进行反转录survivin上游引

5、物P1:5′CGGAATTCATGGGTGCCCCGACGTTG3′；下游引物P2;5′CGGGATCCTCAATCCATGGCAGCCAGC3′.预计片段为420bp同时以人βactin为内参照.βactin的引物序列为：P1：5′TGGGCATGGGTCAGAAGGGATTC3′;P2:5′ATGTCACGCACGCACGATTTCCCG3′，预计片段为502bp.PCR条件以94℃变性5min后，按下述参数循环25次：94℃变性15s，57℃退火40s，72℃延伸1min.　　1.2.4：DNAmarker；1：对

6、照细胞组；2：EGCG60mg/L作用48h.　　图3EGCG作用后A549细胞中survivin的RTPCR检测（略）　　2.4WesternBlot检测survivin蛋白两组细胞βactin，均有显示，量基本相同.对照组survivin蛋白条带明显存在，治疗组同样位置的条带则非常弱.说明其survivin的蛋白表达受到明显抑制（图4）.　　　　研究表明茶多酚对肺癌细胞的生长具有明显的抑制作用.其抑制肿瘤细胞生长的机制尚不十分清楚.陈清勇等［5］应用MTT法体外观察不同浓度茶多酚(I)对人肺癌细胞株(PG)细胞的杀伤作用，结果显示I

7、可明显抑制PG细胞表面CD44，CD54的表达.I对PG细胞和静息血管内皮细胞的黏附性也具有明显的抑制作用，并可抑制黏附分子C7344，CD54的表达，呈剂量依赖关系.I的抗黏附作用可能与其抗肿瘤转移有关.Banerjee等［6］发现茶多酚可以通过抑制Cox2，诱导caspase3表达抑制肺癌细胞的生长.　　本研究通过细胞毒实验（MTT）发现EGCG很小浓度就能抑制A549细胞的生长，Hoechst染色后，发现肺癌细胞经60mg/LEGCG处理后部分染色质固缩，在荧光显微镜下，呈现出致密浓染或碎块状浓染，说明凋亡细胞大量增加.凋亡率明显高

8、于对照组.survivin在许多肺癌组织中表达，是迄今发现的作用最强的凋亡抑制因子［7］.本研究通过oleculartargetsforthecancerpreventiveac