自体prp对成骨细胞ⅰ型胶原蛋白表达的影响

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1、河北医科大学学位论文使用授权及知识产权归属承诺’本学位论文在导师(或指导小组)的指导下，由本人独立完成。本学位论文研究所获的研究成果，其知识产权归河北医科大学所有。河北医科大学有权对本学位论文进行交流、公开和使用。凡发表与学位论文主要内容相关的论文，第一署名单位为河北医科大学，试验材料、原始数据、申报的专利等知识产权归河北医科大学所有。否则，承担相应的法律责任。研究生签名私新签研究生学位论文独创性声明本论文是在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果，除了文中特别加以标注等内容外，文中不包括其他人已经发表或撰写的研究成果，指导教师对此进行了审定。本论文由本人独立撰写，文责自负。研究生签

2、名：球谤导师签矽日目录中文摘要⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯Ol英文摘要⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯04研究论文自体PRP对成骨细胞I型胶原蛋白表达的影响英文缩写⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯08前言⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯09月U舌⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯Uy材料与方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯10结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯20附图⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯·23附表⋯⋯⋯⋯一⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯30讨论⋯⋯⋯

3、⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯31结论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯34参考文献⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯·35综述I型胶原蛋白在成骨过程中的作用及影响因素⋯⋯··38致谢⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯·51个人简历⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯·⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯52中文摘要自体P胛对成骨细胞I型胶原蛋白表达的影响摘要目的：富血小板血浆(platelet-richplasma，PRP)越来越受到人们的重视，它可以作为生长因子的来源与骨髓基质干细胞(bonemarrowstromalstemcells，BMSCs)一起

4、构建种植体周围组织工程化骨。BMSCs进入成骨分化后，可以作为种子细胞应用于骨组织工程研究中。I型胶原蛋白是成骨细胞分泌的，是组成骨组织结构和形成骨力学强度最基本的基质蛋白。本研究采用体外实验，将由兔全血所制备的PRP作用于其自体BMSCs，探讨自体PRP在不同的时间段对BMSCs增殖及分化能力的影响以及对成骨细胞I型胶原蛋白表达的影响，进～步揭示PRP的作用机制，为临床根据生理和病理的需要，对PRP选择合理的应用时间提供实验依据。方法：@BMSCs的培养：应用全骨髓培养法取兔骨髓基质干细胞(，BMSCs)进行原代培养，具体方法为：将2．3月龄新西兰大白兔以戊巴比妥钠经耳缘静脉麻醉，在

5、腿部胫骨平台处以16号骨髓穿刺针垂直骨面，旋转进入骨髓腔，抽取4-6ml骨髓接种于培养瓶，待细胞达到70-80％贴壁融合后予以传代，用倒置显微镜观察原代及传代细胞形态。②绘制细胞生长曲线：于1．10d每日将接种于24孔板内的第三代BMSCs各取3孔，胰蛋白酶消化后置于倒置显微镜下计数，绘制细胞生长曲线。⑧PRP的制备：采用二次离心法分离兔全血制备PRP，仪器计数法获得全血与PRP中的血小板数目。具体步骤为：麻醉实验动物后，分离颈动脉，抽取全血约lOOml，第一次先以1100r／min速度室温离心lOmin，吸取全部上清液及红细胞液面下1-2mm液体，再以2200r／min的速度室温离心

6、lOmin，弃2／3上清液，所剩1／3液体即为PI冲。新鲜获取的PRP以牛凝血酶激活后，立即加入到细胞培养系中。④成骨细胞的鉴定：取第3代生长良好的BMSCs用成骨诱导培养液进行培养后，在特定的时间以碱性磷酸酶染色法及钙结节茜素红染色法验证其成骨分化能力。⑤实验分组：实验组加入含20％PRP的含矿化诱导液的无血清完全DMEM培养液；对照组加入不含PRP的含矿化诱导液的无血清完全DMEM培养液；空白对照组只加入无血清完全DMEM培养液。各组设三复孔。⑥成骨细胞增殖检测：MTT中文摘要法检测增殖，分别在第1、4、7、10d弃去实验组和对照组孔内培养液，加入MTT试剂，37℃孵育4h，再加入

7、二甲基亚砜，结晶均匀溶解后在酶标仪上测各标本的OD值。⑦成骨细胞碱性磷酸酶活性检N-分别在第4、7、10、14d检测实验组和对照组细胞中碱性磷酸酶的含量，遵照碱性磷酸酶检测试剂盒步骤操作。⑧成骨细胞I型胶原蛋白表达检N-分别第在4、9、14、19、24d通过蛋白质印迹法(Western．blot)检测实验组和对照组成骨细胞中I型胶原蛋白的表达水平。结果：①倒置显微镜下细胞形态：原代BMSCs培养2～3d后呈多角形、椭圆形或短梭形，至12d左右可