自体prp对钛表面或成骨细胞增殖的影响及pdgf的变化

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1、河北医科大学硕士学位论文自体PRP对钛表面或成骨细胞增殖的影响及PDGF的变化姓名：杨莉申请学位级别：硕士专业：口腔临床医学指导教师：赵云转201203中文摘要自体PRP对钛表面成骨细胞增殖的影响及PDGF的变化摘要目的：本研究采用体外实验，建立细胞与钛片复合培养的体外培养模型，将由兔全血所制备的富血小板血浆(platelet．richplasma，PRP)作用于其自体骨髓基质细胞(bonemarrowstromalcells，BMSCs)，通过对钛片表面细胞数量及形态各项指标的检测，探讨不同浓度的自体PRP在不同时间段对钛片表面BMSCs增殖的影响以及血小板源性生长因子

2、(PDGF)浓度的变化，进一步揭示PRP的作用机制，为临床根据生理和病理的需要，选择合适浓度的PDGF和PI冲以及合理的应用时间提供实验依据。方法：@BMSCs的培养：应用全骨髓培养法取兔骨髓基质细胞(BMSCs)进行原代培养，具体方法如下：将2．3月龄新西兰大白兔以戊巴比妥钠经耳缘静脉麻醉，在腿部胫骨平台处以16群骨髓穿刺针垂直骨面，旋转进入骨髓腔，抽取4-6ml骨髓接种于培养瓶，待细胞达到90％融合时予以传代，用倒置显微镜观察原代及传代细胞形态。②绘制细胞生长曲线：于1．10d每天将接种于24孔板的第3代BMSCs各取3孔，酶消法消化后显微镜下计数，绘制细胞生长曲线。

3、③钛片的处理：将实验用直径10mm，厚度lmm已打磨光滑的圆形钛片依次用丙酮、无水乙醇、75％乙醇及双蒸水各超声清洗20rai‘n，高温高压消毒30min，无菌保存备用。@PRP的制备：采用二次离心法分离兔全血获得PRP，仪器计数法比较全血与PRP中的血小板数目。具体步骤是，方法同上麻醉实验动物，从颈动脉处抽取所有全血约120ml，第一次先以1100r／min速度水平离-tl,机室温离心10min，吸取全部上清及红细胞液面下2-3mm，再以2200r／min的速度离心10min，弃2／3上清，所剩1／3液体即为PRP，以牛凝血酶激活后2小时内加入到细胞培养系中。⑤PRP作

4、用于BMSCs：将配制的含不同浓度PRP(0％、10％、20％、30％)的诱导培养液作用于生长良好的已在钛片表面适应性生长24h的第4代BMSCs，每孔设3复孔，另设空白对照组。⑥成骨细胞鉴定：取第3代BMSCs用成骨诱导培养液进行培养后，以碱性磷酸酶染色法及钙结节染色法验证其成骨分化能力。@MTT法检测增殖：分别在第1、4、7、10d取各孔实验组，弃去孔内培养液，中文摘要清洗后加入MTT试剂于钛片上，37℃孵育4h，再加入二甲基亚砜，结晶均匀溶解后在酶标仪上测各标本的OD值。⑧ELISA法测PDGF．AB浓度：分别在第0、1、2、3、4d取各钛片组细胞的上清液，根据兔E

5、LISA试剂盒说明检测各标本中PDGF．AB的OD值，并在标准曲线上获得PDGF．AB浓度。⑨荧光染色观察钛片表面细胞形态：在第4、7、10d取出各实验组钛片，固定后以荧光染色剂F．actin对细胞骨架进行荧光染色，再以DAPI最后复染细胞核，正置荧光显微镜下观察。结果：①倒置显微镜下细胞形态：原代BMSCs呈短梭形，至12d左右可达到80％融合，此时细胞形态为均一的长梭形，漩涡状排列，传代后的细胞形态比原代细胞更为均一，增殖迅速。根据生长曲线图可知，传代培养潜伏期一般为2．3d，4．8d为对数生长期，9．10d增殖趋于稳定，达到平台期，细胞增殖趋于平缓。②成骨能力鉴定：

6、经成骨诱导后，碱性磷酸酶染色结果示细胞胞浆中出现红棕色、棕褐色或咖啡色颗粒，钙结节染色示结节处有橘红色钙盐沉积，即为钙化结节，均呈阳性表达，表明所培养的BMSCs具备成骨分化能力，为成骨细胞。③PRP的检N-采用二次离心法得到的PI冲中血小板数目为864+37x109／ml，是全血201+26x109／ml的4．3倍。PRP经激活后，析出的上清液经兔ELISA试剂盒检测PDGF—AB值在标准曲线上能获得值为95．537+5．112ng／ml，二次离心法制备的PRP中含有高浓度的生长因子PDGF。AB。④MTT检测增殖结果：20％PRP组第7d时OD值最高，在第4d20％>

7、30％>10％，差异有统计学意义(P10％>30％，差异有统计学意义(P