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1、观察胶原蛋白对成纤维增殖及小鼠伤口愈合的影响 皮肤损伤创面治疗是临床常见问题,如患者伴有免疫功能低下及糖尿病等疾病,伤口通常较难愈合,如何促进创面愈合并提高愈合质量一直是研究的热点。创伤修复是由多种细胞、细胞因子参与、且相互作用的复杂过程,胶原蛋白作为细胞外基质重要组成成分可促进多种细胞如成纤维细胞、内皮细胞的迁移、分化和增殖,并可促进生长因子等细胞因子的产生,促进伤口愈合。Chai等发现,将荧光标记的鱼鳞胶原蛋白置于小鼠皮肤表面,鱼鳞胶原蛋白可透过皮肤角质层,并可活化成纤维细胞,增强皮肤的弹性及保湿性。Castillo-Briceo等研究发现:胶原蛋白中的GFOGER、GLOGEN结构
2、域可促进成纤维细胞的黏附、增殖及IL-1β基因的表达。利用胶原蛋白胶制成的敷料治疗糖尿病小鼠皮肤溃疡,治疗第7天,可使伤口缩小62%。目前,天然胶原蛋白主要于畜类及禽类动物组织,但由于疯牛病、口蹄疫、禽流感等疾病的爆发,使陆生哺乳动物胶原蛋白的安全性普遍受到质疑。我国水产品丰富,在加工鱼产品同时产生大量下脚料,其中鱼鳞约占总质量5%,通常被当作垃圾丢弃,我国每年丢弃的鱼鳞约有30万吨。蛋白质是鱼鳞的主要成分,约占总重的70%,其中主要是胶原蛋白和鱼鳞硬蛋白。本室的前期工作表明,水提法提取的鱼鳞胶原蛋白可清除氧自由基,提高超氧化物歧化酶(superoxidedismutase,SOD
3、)、过氧化氢酶(catalase,CAT)含量,具有良好的生物学活性。在此基础上,本研究利用水提法提取鱼鳞胶原蛋白,观察胶原蛋白对成纤维增殖及对免疫功能低下小鼠伤口愈合的影响,为鱼鳞胶原蛋白开发利用及损伤修复治疗研究奠定基础。 1、材料与方法 1.1材料 鱼鳞取自牡丹江市新玛特超市(新鲜的各种鱼鳞混合物)。BALB/C小鼠,雌雄各半,体重18~20g;3日龄内I1640培养基为Gibco公司产品,ELISA试剂盒为RD公司产品,引物由上海生工生物工程有限公司合成,SYBRPremixExTaqTM为TaKaRa公司产品。 1.2方法 1.2.1鱼鳞胶原蛋白膜制备:①鱼鳞前处理:新鲜
4、鱼鳞清水冲洗→烘干→1%盐酸溶液脱钙→清水、蒸馏水冲洗→调pH值→烘干,备用。②水提法制备鱼鳞胶原蛋白膜:取适量经处理鱼鳞,捣碎,按1∶30比例加入蒸馏水,100℃水浴30min,80℃水浴1.5h,4℃、8000r/min离心20min,取上清,经0.45μm滤膜过滤除菌后,于超净台内自然干燥后即得鱼鳞胶原蛋白膜。③胶原蛋白含量测定:采用对二甲基氨基苯甲醛比色法测定胶原蛋白特征氨基酸-羟脯氨酸的含量,测得值11.1即为胶原蛋白的量。提取率=提取的胶原蛋白量/鱼鳞中总的胶原蛋白量100%。 1.2.2鱼鳞胶原蛋白对大鼠真皮成纤维细胞增
5、殖的影响:大鼠真皮成纤维细胞分离:取3日龄内的TT法检测鱼鳞胶原蛋白对大鼠真皮成纤维细胞增殖的影响:取适量无菌胶原蛋白膜,用1640培养液溶解制成浓度为5、10、20、40mg/L液体,与生长状态良好的大鼠真皮成纤维细胞4103个共同培养于96孔板中,未加胶原蛋白孔为空白对照。培养48h后,每孔加入MTT溶液(5g/L)20μL,继续培养4h。弃上清,每孔加入DMSO溶液150μL,振荡10min,于490nm处检测吸光度(OD)值。增殖率E(%)按以下公式计算。E(%)=(A样品-A0)/A0100%(A0为空白对照组吸光度值;A样品为胶原蛋白组吸光度值)。 1.2.3免疫低
6、下小鼠皮肤损伤模型制备:利用环磷酰胺诱导小鼠免疫低下。将小鼠腹腔注射环磷酰胺50mg/kg,每天1次,连续2天,建立小鼠免疫低下模型。随机取正常小鼠10只,作为正常组;取免疫低下小鼠40只,随机分为4组(模型组、鱼鳞胶原蛋白1mg、0.5mg、0.25mg组)。乙醚麻醉,背部去毛,消毒,用特制打孔器在小鼠背部打一直径为1cm的圆形孔,切除皮肤全层。造模第1天,正常组、模型组伤口处覆盖无菌纱布,鱼鳞胶原蛋白组伤口处覆盖含量为1mg、0.5mg、0.25mg的鱼鳞胶原蛋白膜,每日更换纱布及给药1次,观察伤口愈合情况,并将创面描记在半透明纸上,计算创面面积大小,按以下公式计算创面愈合率,创面愈合率
7、(%)=(开始创伤面积-未愈合创面面积)/开始创伤面积。 1.2.3.1检测PDGF、TGFβmRNA表达:皮肤损伤后第5、7、10天切取模型组、鱼鳞胶原蛋白1mg组、正常组伤口组织,匀浆器研磨,利用Trizol试剂法提取RNA。取1μgRNA利用M-MLV逆转录酶法合成cDNA。PCR采用SYBRGreen染料法,PDGF上游引物为5'-CCTGCCCATTCGGAGGAAGAG-
