草鱼4个补体基因克隆表达和连锁及与细菌性败血症的关联分析

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1、学校代码：10264研究生学号：D090101006上海海洋大学博士学位论文草鱼4个补体基因克隆表达和连锁及与题目：细菌性败血症的关联分析Cloning,Expressionandlinkagemappingoffourcomplementgenesandtheirassociationwith英文题目：resistancetobacterialhemorrhagicdiseaseingrasscarpCtenopharyngodonidellus专业：水产养殖研究方向：水产动物种质资源与种苗工程姓名：沈玉帮指导教师：李家乐教授、张俊彬教授二O一三年六月上海

2、海洋大学学位论文原创性声明本人郑重声明：我恪守学术道德，崇尚严谨学风。所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中已经明确注明和引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品及成果的内容。论文为本人亲自撰写，我对所写的内容负责，并完全意识到本声明的法律结果由本人承担。学位论文作者签名：日期：年月日上海海洋大学学位论文版权使用授权书[1]学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅或借阅。本人授权上海水产大学可以将本学位论文的

3、全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。保密□，在年解密后适用本版权书。本学位论文属于不保密□学位论文作者签名：指导教师签名：日期：年月日日期：年月日上海海洋大学博士学位论文答辩委员会成员名单姓名工作单位职称备注陈立侨华东师范大学教授主席卢大儒复旦大学教授杨先乐上海海洋大学教授成永旭上海海洋大学教授吕利群上海海洋大学教授答辩地点水产与生命学院D101答辩日期6月5日上海海洋大学博士学位论文草鱼4个补体基因克隆表达和连锁及与细菌性败血症的关联分析摘要草鱼(Ctenopharyngodonidellus)是我

4、国最主要淡水养殖对象，其产量一直位居我国和世界养殖鱼类第一。在养殖过程中草鱼病害频繁发生，各种传染性疾病的暴发每年都给草鱼养殖业带来了巨大的经济损失。开展草鱼免疫相关基因的功能研究，阐明其与抗病力的相关性，将为草鱼抗病分子育种提供重要的理论基础。本研究拟从克隆获得的草鱼补体Bf/C2、C6和C7基因入手，对其进行结构、连锁和组织表达分析，初步了解其生物学功能，并检测它们内部的基因多态性，进行不同基因型或单倍型与草鱼细菌性败血症的关联分析，以期筛选出有育种指导价值的优势基因型，取得的结果如下：1.草鱼4个补体基因的克隆与表达根据EST拼接成的连接群或斑马鱼的c

5、DNA序列设计引物，从草鱼基因组中克隆到补体Bf/C2A、Bf/C2B、C6、C7基因的部分序列。采用RACE方法获得了4个补体基因的cDNA全长序列，并推导出相应的氨基酸序列，与其它物种的相同基因序列进行了比较分析。这4个基因cDNA序列已提交到GenBank数据库，登录号分别为JF47038，JF47039，HQ416903，JN655169。采用Real-timePCR技术检测了补体Bf/C2A、Bf/C2B、C6、C7基因在健康草鱼成体组织、诱导后不同时点组织和不同发育时期的表达情况。结果显示，补体Bf/C2A、Bf/C2B、C6基因在所检测的12个

6、组织中都有所表达，其中肝和脾中的表达量最高，但C7只有在头肾、中肾、皮肤、脾、心脏和肠中进行了表达。经福尔马林灭活嗜水气单胞菌诱导后，Bf/C2A、Bf/C2B、C6、C7基因在所检测的组织中出现了显著上调。补体C6mRNA在未受精的卵中转录。孵化1dC6mRNA转录显著上升，到第10d又开始下降，这表明补体C6在草鱼胚胎和鱼苗早期起到免疫保护的作用。2.草鱼补体C6、C7基因的连锁分析对补体C6、C7基因在作图家系4个亲本中进行多态性位点筛选，在补体C6基因第4号外显子上获得了1个SNP位点，在补体C7基因第5号内含子上发现了I上海海洋大学博士学位论文1个

7、SNP位点。将这两个位点在两个作图家系192个子代中进行了基因分型，通过连锁分析发现补体C6、C7基因都位于草鱼第3号连锁群上，而且彼此紧密连锁，分布在微卫星标记CID0050和CID0190之间。3.草鱼补体C6、C7基因的多态性与细菌性败血症的关联分析采用人工感染嗜水气单胞菌的方法，建立了草鱼易感群体(186尾)和抗病群体(191尾)，用于连锁分析。使用基因组步移法获得了补体C6、C7基因的启动子序列，分别为1130bp和1107bp。使用PCR方法获得了补体C6、C7基因组DNA全长分别为9288bp和7068bp，都包括18个外显子和17个内含子。在

8、草鱼C6基因中共发现了9个潜在的SNPs位点，其中编