膀胱癌顺铂耐药与其基因甲基化相关性研究

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1、博士学位论文论文题目膀胱癌顺铂耐药与其基因甲基化相关性研究研究生姓名张青川指导教师姓名单玉喜教授专业名称外科学研究方向泌尿系统肿瘤论文提交日期2013年9月膀胱癌顺铂耐药与其基因甲基化相关性研究中文摘要膀胱癌顺铂耐药与其基因甲基化相关性研究中文摘要目的：通过了解顺铂耐药膀胱癌细胞中DNA甲基化谱的改变，探索与发生顺铂耐药密切相关的基因的甲基化及其蛋白表达的变化，为阐明膀胱癌化疗耐药机制提供新的实验依据。方法：（1）顺铂耐药膀胱癌细胞株的建立：利用顺铂浓度梯度递增法(0.2-2.0mg/L)，在T24膀胱癌细胞中建立顺铂耐受的细

2、胞株亚型（T24/DDP），并对细胞的各项生物学指标进行检测，包括顺铂敏感性、细胞形态学、细胞生长曲线及细胞周期等。（2）顺铂耐药膀胱癌细胞DNA甲基化谱分析与耐药相关甲基化基因的筛选：DNA甲基化芯片对T24及T24/DDP细胞基因组的DNA甲基化谱进行分析，并通过统计学方法，筛选高甲基化，及低甲基化修饰基因。利用realtime-PCR方法对筛选出的具有表达差异的甲基化修饰基因进行分析，并结合文献资料，最终采用MSP法，对筛选出的甲基化修饰基因进行进一步的验证分析。（3）通过5-氮杂-2-脱氧核苷去甲基化了解顺铂耐药膀胱癌

3、细胞生物学的作用；并对细胞生物学指标进行检测。（4）采用5-氮杂-2-脱氧核苷去甲基化了解逆转顺铂耐药膀胱癌细胞的分子机制：利用realtime-PCR及westernblot方法，对T24/DDP及经5-氮杂-2-脱氧核苷去甲基化处理T24/DDP细胞中关键基因及其蛋白的表达进行分析。结果：（1）成功建立顺铂耐药的膀胱癌细胞（T24/DDP）：DDP敏感性实验表明，在20ug/ml浓度的DDP处理下，T24细胞死亡率接近100%，而同样浓度下顺铂耐受的细胞株亚型T24/DDP细胞的死亡率则是30%。细胞生长曲线表明，T24与

4、T24/DDP细胞的倍增时间分别为72.5和90.2小时。细胞形态学观察表明，T24与T24/DDP细胞形态学无明显差异。细胞周期分析表明，T24/DDP细胞中G0/G1期细胞比例显著增加，G2/M期细胞下降。I中文摘要膀胱癌顺铂耐药与其基因甲基化相关性研究（2）顺铂耐药膀胱癌细胞DNA甲基化差异基因筛选：利用DNA甲基化谱芯片对T24及T24/DDP两个细胞系的基因组DNA甲基化谱进行分析，发现1120个甲基化差异位点；并筛选出40个高甲基化，18个低甲基化修饰基因。然后通过realtime-PCR方法对该58个差异甲基化修

5、饰基因的表达进行了分析，发现其中30个基因的表达有统计学差异。结合文献资料，又筛选出和本研究相关基因20个，采用MSP法，对这些基因的甲基化修饰在细胞水平上又进行了验证分析，最终筛选出与甲基化谱芯片结果一致的15种基因，包括14种高甲基化和1种低甲基化修饰基因。（3）5-氮杂-2-脱氧核苷去甲基化对顺铂耐药膀胱癌细胞的生物学作用：经去甲基化处理后，之前发现的14种高甲基化修饰差异基因中的7种基因的高甲基化修饰被改变：ABCC6，CCNA1，HPP1，ITGA4，RASSF1A,RUNX3，TMS1。同时去甲基化处理后，T24/

6、DDP细胞对于顺铂的敏感性显著提高、细胞凋亡比例增加、S期细胞比例显著增加。（4）5-氮杂-2-脱氧核苷去甲基化逆转顺铂耐药膀胱癌细胞的分子机制研究：利用realtime-PCR和westernblot方法的分析结果表明，上述7种基因（ABCC6，CCNA1，HPP1，ITGA4，RASSF1A,RUNX3，TMS1），经5-氮杂-2-脱氧核苷去甲基化处理后，其mRNA及蛋白的表达水平显著增加。结论：（1）顺铂浓度梯度递增法所建立的T24/DDP细胞株对顺铂具有很好的耐受性，可以作为体外模型用于顺铂耐药机制的研究。（2）膀胱癌

7、细胞发生顺铂耐药时，细胞基因组存在广泛的DNA甲基化修饰改变。（3）5μM5-氮杂-2-脱氧核苷处理T24/DDP细胞，能使部分高甲基化修饰基因发生去甲基化，而提高T24/DDP细胞对于顺铂的敏感性。（4）ABCC6，CCNA1，HPP1，ITGA4，RASSF1A,RUNX3，TMS1等7种基因的甲基化修饰可能在介导顺铂耐受作用机制中发挥重要作用。关键词：膀胱癌顺铂耐药甲基化基因芯片作者：张青川指导教师：单玉喜教授II膀胱癌顺铂耐药与其基因甲基化相关性研究英文摘要StudyaboutCisplatin-resistanceo

8、fbladdercancercellsandtheirDNAmethylationpatternAbstractObjective:ToinvestigatetheDNAmethylationprofileofcisplatin-resistanceinbladdercanc