新型恶性疟原虫(plasmodium falciparum)基因表达平台的建立

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1、北京协和医学院硕lj研究牛学位论文硕士学位论文学校代码：10023学号：s2010005060新型恶性疟原虫(Plasmodiumfalciparum)基因表达平台的建立所院：姓名：指导教师：北京协和医学院基础学院面目贝lab王恒教授导师小组：张伟教授崔莲仙教授学科专业：病原生物学研究方向：分子寄生虫学完成日期：2013年5月北京协和医学院硕：i：研究牛学位论文目录摘要⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．3ABSTRACT⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯4前言⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯

2、⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．’⋯5实验材料⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．8、实验试剂⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯8二、丰要仪器设备⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．12i、主要分析软件⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．13pq、丰要溶液配制⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯13实验方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯16一、常用的分子生物学方法⋯

3、⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯16二、疟原虫培养⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一23i、转染⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．27实验流程图⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯33实验结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯34第一‘部分伯氏疗原虫Pbl596以及目标质粒pLl628的鉴定⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．34第_部分外源基凶的鉴定及载体构建⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．38

4、第三部分几的质粒转染们氏疟原虫Pbl596条件的初步探究⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．48第四部分体外培养疟原虫方法的优化⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯56第五部分药物筛选方法的改进⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．59讨论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯60小结⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯64参考文献⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯65附录⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯

5、⋯⋯⋯⋯⋯⋯．68致谢⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．712北京协和医学院硕：I：研究牛学位论文摘要疟疾是世界上最严重的感染性疾病之一，一直以米都威胁着人类健康，其中恶性疟原虫所导致的危害最为严重。随着分子生物学技术的不断发展，对于疟原虫的相关研究也日益深入，尤其疟原虫基因及其编码蛋白功能的揭示为疟疾防治提供了新的思路。而通常用于研究的基因外源表达体系均因为恶性疟原虫基因组巾高AT含量产生的密码．了偏爱性、包涌体形成等原因，使恶性疟基因体外表达凼难重重。2011年，荷兰莱顿大学ShahidKhan教授课题组成功建立了G

6、IMO体系，为恶性疟原虫基因的表达与修饰提供了一个崭新平台。本实验中所用目的基因pfm／f与pfmag-1是由本实验室保存的恶性疟原虫基凶，前期已对其做到过深入研究，证明二者均在恶性疟原虫引起的免疫反应及其与宿主间相互作用中发挥重要作用，但对于全长pfmag一，基因的表达却一直没有成功，因此，本研究试图以较好表达的pfmif基因作为技术对照，通过表达pfmif和pfmag-I全长基因在本实验室建立GIMO技术平台系统，为深入研究疟原虫的生物学特性奠定实验基础。实验中首先通过酶切插入法重新构建质粒m／f-1628、mag．J．1628，其次通过优化伯氏

7、疟原虫体外培养方法，提高了成熟裂殖体含量的基础上避免了游离裂殖子的流失，并缩短了实验岗期。同时，改进了药物筛选方法，将GIMO体系中腹腔注射的用药方式(注射剂量为0．49／kg·day)转变为饮用水用药(1．5mg／mL)，相对于原方法成功抑制了野生型伯氏疟原虫的生长，更有利于目的整合虫株的筛选。综上所述，本实验中成功构建了包含外源基因的目的质粒，并优化了伯氏疟原虫体外培养与药物筛选方法，为今后的实验奠定了良好基础，此外，后期的转染实验仍在继续。关键词：GIMO；质粒构建；体外培养；药物筛选；转染北京协和医学院硕：I：研究牛学位论文ABSTRACTM

8、alaria，oneofthemostimportantinfectiousdiseaseintheworl