恶性疟原虫pfrnaseⅱ的克隆表达与降解特性的性状分析

《恶性疟原虫pfrnaseⅱ的克隆表达与降解特性的性状分析》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在应用文档-天天文库。

1、恶性疟原虫PfRNaseⅡ的克隆表达与降解特性的性状分析　　在真核生物中，DNA转录生成RNA，然而其中只有极少部分的RNA编码蛋白质，大部分基因组序列转录生成非编码RNA(ncRNA)。ncRNA根据其功能的不同可分为持家ncRNA和调节ncRNA，其中调节ncRNA曾被认为是转录噪音。随着测序技术的发展，越来越多的研究表明ncRNA可在转录、转录后以及表观遗传等水平来调控基因的表达，从而参与机体的生长发育、疾病发生以及病原体毒力相关基因的表达等过程。尽管RNA在生物体中发挥重要作用，然而RNA的新陈代谢

2、离不开核糖核酸酶特别是核糖核酸外切酶的参与。研究表明核糖核酸外切酶与病原体的毒力表型有关，其机制尚不清楚，可能与核糖核酸外切酶参与RNA的加工、降解、稳定等过程有直接或间接的联系。恶性疟原虫是疟疾的主要病原体之一，致病力强，致死率高，对人类的危害严重。　　张青锋等研究发现恶性疟原虫中存在一种核糖核酸外切酶PfRNaseⅡ，该酶通过降解新生RNA从而介导与重症疟疾相关的毒力基因(upsA亚类基因)的沉默。　　本实验通过体外扩增恶性疟原虫3D7株PfRNaseⅡ的催化活性区，构建重组表达载体，然后利用原核表达系

3、统诱导表达GST标签融合蛋白质，纯化后进行RNA降解活性测定，为解析PfRNaseⅡ基因结构组成及其降解机制研究奠定基础。　　材料与方法　　1材料　　1.1虫株与菌株大肠埃希菌DH5α、BL21-Codon-Plus(DE3)和恶性疟原虫3D7虫株均由本室保存。　　1.2主要试剂ExTaq?DNA聚合酶，dNTP，DL2000TMDNAMarker，DL15000TMDNAMarker，限制性内切酶BamHⅠ、EcoRⅠ，T4DNA连接酶，pMDTM18-TVectorCloningkit均购自

4、于大连宝生物公司;Glutathione-SepharoseTM4B购于美国GEHealthcare公司;GST-tagMousemAb购自于天津三箭生物有限公司;碱性磷酸酶标记山羊抗小鼠IgG和BCIP/NBT购于美国Sigma公司;DNAGelExtractionKit和PlasmidMiniprepKit购于美国BIOMIGA公司;其他试剂均为国产或进口分析纯。　　2方法　　2.1序列分析与引物合成根据疟原虫专业X站(.plasmoDB.org)提供的序列信息，对恶性疟原虫3D7株PfRNaseⅡ(P

5、F3D7_0906000)基因编码区进行保守结构域分析，显示该蛋白质氨基酸序列的870～1322区段为RNBdomain，该结构域是RNaseⅡ的特征性结构域和催化活性区。根据编码序列设计特异性引物，并在引物的5'端分别添加酶切位点。上游引物：5′-GGATCCTTAGAAAAATATATGTTGAAAAGCT-3′(划线部分为BamHⅠ酶切位点序列)，下游引物：5′-GAATTCAATATTATCTTGATCAATTAAACTTTGT-3′(划线部分

6、为EcoRⅠ酶切位点序列)。引物由长春库美生物公司合成。　　2.2目的片段的扩增以cDNA(本室保存)为模板，PCR扩增上述的目的基因片段。PCR反应程序：94℃预变性4min;94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸90s，共35个循环;72℃再延伸10min。扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳鉴定。　　2.3重组表达载体的构建取PCR产物与pMD18-T载体连接，连接产物转入DH5α后涂板，经PCR、测序鉴定为阳性的重组pMD18-T-PfRNaseⅡ载体质粒与原核表达载体pGEX-4T-

7、1质粒分别进行BamHⅠ、EcoRⅠ双酶切(37℃酶切反应2.5h)，酶切产物经0.8%琼脂糖凝胶电泳分离后，按BIOMIGA试剂盒说明书切胶回收。将回收的载体片段与目的片段按摩尔比5︰1混合，在T4DNA连接酶的作用下于16℃水浴连接过夜，连接产物转入DH5α后涂板，经PCR、双酶切、测序鉴定正确的重组表达载体质粒pGEX-4T-1-PfRNaseⅡ转入BL21-CodonPlus(DE3)中。测序鉴定均由哈尔滨博仕生物公司完成。　　2.4融合蛋白质的诱导表达与纯化将转染pGEX-4T-1-P

8、fRNaseⅡ的DE3划线接种于固体LB培养基中37℃培养12h以上，挑取单个菌落接种于5ml液体LB中扩大培养。取适量菌液按1︰100接种继续扩大培养，当A600值为0.6左右时，加入终浓度为100μmol/LIPTG诱导表达目的蛋白质。于16℃诱导表达12h后收集菌体，用适量TBS重悬，然后加入终浓度为1%TritonX-100和2mmol/L的PMSF混匀，超声破碎菌体。用Glutathione-Se