恶性疟原虫乳酸脱氢酶的表达、纯化、单克隆抗体的制备及鉴定

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3、ino-melbanee兰羟甲蓦氨赫甲烷磷呻叫l蓁『蛳暾懿一哪秘一时躐鼢口疆一腿翳一娜啪．羞一GoM-immunocl'a'omatographyassay免疫胶体金滕析。{．恶性疟原擞乳酸脱氢酶的表达、纯化、单克隆抗体的铡备及鉴定(中文摘要)碾±磷究生：李薅导师：李明朱佐江教授疟痰是一静严重熊密人类健康盼虫媒性传染病，尤其在热带、亚热带遥区流行广泛。旗WHO统诗，全球每年育遥3-5亿入臻染瘀疾，其中约300万人死亡。在我国也有24个省、市及自治区不同程度地存在疟疾流行。据我国卫生部癜疾委员会最新资料显示，南部地区如爱南、广西、海枣等键疟疾发藏零较往

4、年帮套不潮摆疫懿曩藏，霞j邈，癌痰爨舞澹始终是寄鬣盈病研究的瀵点之一。疟痰的诊断是瘀疾防治工作巾的一个重要环节，目前疟疾诊断技术正朝着简便、快速、灵敏、特异及结果易于判定的方越发展，两以单抗为基础鹃Dipstick免疫层析技术其有以上优点，森麓裁景广泛。本研究鏊奁肇l瘸疟蘸虫瓣巍酸驻氢酶(1actatedehydrogenase，LDH)为诊断靶抗原，通过对该蛋白进行巍隆、表达，制备单抗，并筛选、配对建立反威模式等系列研究，开发用于疟疾快速诊叛的兔疫屡辑硷测试潮盒。研究中，首先将恶性疟原虫酶LDH(Ptasmodiumfalciparumlactat

5、edehydrogenase，LDHpf)基因克隆至pET一23a(+)表达载体中，构建pET23-LDH重组质粒。重组质粒在BL21中得到蕊效表达，SDS-PAGE显示表这蛋穗分子量鳕势33KDa，与纛霞擐遵懿臻滚盔LDH努予蠹理论毽(31-36Kda)基本符合。表达产物冰浴超声破荫，发现目的髓白大部分溶于上清中，为可溶性表达，密度扫描显示目的蛋白占菌体总蛋白的4l。2％。漾爝Q-SepharoseHighPerformance羧离子交换树麟牲层辑对pET23-LDH重组蛋白滋行纯纯，SDS～PAGE电泳疑凝胶光密壤瀚蒙分桩系统检测主蛋白纯度可达8

6、9．1％，浓度为400pg／ml。用纯化的藏组蛋白免疫BALB／c小鼠制备免疫血清，ELISA结果显示兔疫小鼠血清与pET23一LDH表选产物出现明显反应，而对空载体PET-23a表达产物无反废。Westernblot分析表明特异性鼷带出现在33kDa处，而空载体诱导后表达的产物无隧带出现。进一步用该免疫血清与恶性瘀原虫和间日疟原嫩反应，Westernblot结果表明免疫血清能识别恶性癌原虫和闻曰癌原威33KDa赴焱源蛋鑫，瑟与来感染瓣红绥憝不发生交叉爱应，提示pET23一LDH重缎援自具有良好的抗艨馊和免疫原性。以纯化后的LDH黧组蛋白免疫BALB

7、／c小鼠，取其脾细胞岛小鼠骨髓瘤绷胞SP2／O进行融合，融合细胞用HAT培养基作选择性培养。采用间接ELISA法筛选阳性杂交瘤细胞株，获得ll株能分泌高效价和潞特异性瓣撬LDH重缝蛋自擎羧熬杂交癯缨腿攮。lg类与亚类鉴定续浆浚2811、3C9、3010、6D3、7D2、IE7、6G7、IC6、2D7重链类壅为IgGl亚类，轻镪为K型；2F12重链类型为IgG2豫擞，轻链为K型；2C6重链类型为IgGi亚类，辕链为凡型。11株单抗焙养上清的ELISA散价为1：100～I：400，腹水效价为i：6400～I：51200。从而可为恶性瘢原虫免嶷羧俸金快速诊

8、断试剂鑫鳃礤隶4提供抗体。零l瑶锪耪藐酸铰缝纯惹豹li拣单藐，建立了蠢薅诊攀繇憋疟骧虫蠢阔跨疟原虫的GICA