恶性疟原虫顶端膜抗原1基因转染伯氏疟原虫模型的建立

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1、恶性疟原虫顶端膜抗原1基因转染伯氏疟原虫模型的建立陈俊，缪军，刘忠湘，李淑梅，薛采芳【关键词】伯氏疟原虫；恶性疟原虫；顶端膜抗原1；转染【Abstract】AIM:ToestablishthemodelofPlasmodiumberghei(P.berghei)transfectedodiumfalciparum(P.falciparum)apicalmembraneantigen1(AMA1)gene.METHODS:ThetransfectionplasmidpDB.DTm.DB./AB.AF.DB.containingP.falciparumA

2、MA1edbyBglI.BloodstagesofP.bergheiatureschizontsice.Transfectedparasitesiceethamine.DNAoftransfected,resistantparasitesAMA1plifiedbyPCRinthetransfectedparasites.CONCLUSION:ThemodelofP.bergheitransfectedAMA1geneodiumberghei；Plasmodiumfalciparum；apicalmembraneantigen1；transfectio

3、n【摘要】目的：建立恶性疟原虫顶端膜抗原1（AMA1）基因转染伯氏疟原虫的模型.方法：将含有恶性疟原虫AMA1基因的重组转染质粒pDB.DTm.DB./AB.AF.DB.用BglI酶切线性化.伯氏疟原虫经体外培养和分离后进行电转化，转化的原虫经药物筛选后进行PCR检测.结果：PCR检测显示转染伯氏疟原虫存在恶性疟原虫AMA1基因.结论：成功建立了恶性疟原虫AMA1基因转染伯氏疟原虫的模型,为进一步研究提供了基础.【关键词】伯氏疟原虫；恶性疟原虫；顶端膜抗原1；转染0引言疟疾是世界上对人类危害最严重的传染病之一.目前药物和疫苗对疟疾，尤其是恶性疟的防治

4、效果均不理想.对疟原虫生物学特性的深入研究可能为疟疾防治提供新的思路.疟原虫转染技术的应用，为进一步研究疟原虫的生物学特性，特别是蛋白质结构与功能提供了有效的实验手段〔1〕.顶端膜抗原1（AMA1）是疟疾红内期疫苗的重要候选抗原.在鼠疟模型和猴疟模型中，鼠和猴疟原虫AMA1可诱导保护性免疫的产生〔2-3〕.我们建立了恶性疟原虫AMA1基因转染伯氏疟原虫的模型,为更深入研究恶性疟原虫AMA1的功能及评价恶性疟原虫AMA1特异性抗体在体内的保护性作用提供了新的工具.1材料和方法1．1材料水平式离心机(北京医疗仪器厂产品,型号LXJ6401)，电穿孔仪Nu

5、cleofectorDevice（Amaxa）.伯氏疟原虫ANKA株由我室保存.清洁级.DB./AB.AF.DB.〔4〕含有伯氏疟原虫的二氢叶酸还原酶/胸腺嘧啶合成酶突变体基因（DHFR/TS），提供乙胺嘧啶抗性,由德国海德堡大学Bujard教授惠赠.核酸内切酶BglI（大连TaKaRa），凝胶回收试剂盒（上海华舜生物工程公司），胎牛血清(Gibco)，Nycodenz(AxisShield)，乙胺嘧啶(Sigma)，HumanTCellNucleofectorKit(Amaxa).1.2方法1．2．1转染质粒的线性化重组转染质粒pDB.DTm.DB

6、./AB.AF.DB.用BglI酶切后，胶回收线性化片段，将浓度稀释为1g/L，-20℃保存备用.1．2．2伯氏疟原虫的培养液氮中保种的伯氏疟原虫ANKA株经腹腔接种昆明小鼠，待原虫率达5％～15％，鼠尾静脉取血,以40μL/只腹腔接种L/L的胎牛血清洗涤1次，用水平式离心机以1500r/min离心8min.洗涤后的细胞用250mL/L的胎牛血清重悬后加入锥形瓶，并在瓶中注入含50mL/LCO2,50mL/LO2和900mL/LN2的混合气体，将瓶口封严后置于37℃以30r/min低速振摇培养22h.1．2．3成熟裂殖体的分离在Nycodenz细胞分

7、离液上小心加入体外培养的原虫，用水平式离心机以1500r/min离心30min.含有成熟裂殖体的红细胞位于两层悬浮液之间，呈棕色.小心吸取棕色层的细胞，用250mL/L的胎牛血清洗涤1次，以1500r/min离心8min.1．2．4电穿孔转化将原虫按1×107重悬于100μL含10μg转染质粒的“HumanTcellNucleofectorSolution”缓冲液.重悬后的液体加入电转杯，用电穿孔仪NucleofectorDevice进行电穿孔转化，程序设定为U33.电转化后迅速向电转杯加入50μL细胞培养液进行重悬.1．2．5转化原虫的筛选将上述1

8、50μL重悬液经尾静脉注射昆明小鼠.24h后将乙胺嘧啶按10mg/kg腹腔注射感染转化原虫的昆明小鼠，每日注