疟原虫基因转染探究进展

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1、疟原虫基因转染探究进展关键词：恶性疟原虫；PlasmodiumfalciparumP.f；基因转染；病原生物随着恶性疟原虫(Plasmodiumfalciparum,P.f)2号［1］、9号［2］和3号［3］染色体序列的相继明了，关于P.f基因组的研究大大向前迈进了一步，在未来的2〜3年内，将有可能对其全部基因组序列分析完毕。毫无疑问，疟原虫研究即将或已经进入后基因组时代［4］。对疟原虫各种基因及其基因产物的功能研究是发现有效疫苗和抗疟药物作用靶位的必要前提，但许多基因的功能，尤其是与疟原虫致病力有关的重要基因的功能尚未得以阐明，因而影响了疟疾的防治工作。以往的基因功能研究局限于与

2、已知功能基因的比较和间接地推测，近年来发展的疟原虫基因转染技术［5］可通过改变基因后观察表型变化在活体研究基因的功能，使疟原虫基因的研究现状大为改观。不仅如此，该技术也使疟原虫基因表达调控、药物抗性研究、细胞生物学以及疫苗的研究均出现了崭新的技术性变化。在四种感染人的疟原虫中，P.f的致病性最为严重，其研究历来倍受重视，本文就疟原虫(主要是P.f)基因转染方面的研究作一综述。1疟原虫基因转染的种类1.1短暂转染自70年代末Hinnen等［6］建立酵母转染技术以来，真核细胞的转基因技术在基因调控和基因功能的研究中起到了极其重要的作用。1993年Goonewardence等［7］首先进

3、行了疟原虫基因转染开创性的工作，为疟原虫基因转染技术的不断发展和广泛应用奠定了基础。作者将虫荧光素酶(fireflyluciferase)基因插入鸡疟原虫(Plasmodiumgallinaceum,P.g)有性期基因pgs28的编码区，构成嵌合基因后克隆入质粒载体PUC13,以电穿孔法导入P.g的雌配子和受精的合子，24小时后检测到虫荧光素酶的短暂表达。两年后，Wu等［8］报导了P.f环状体的短暂转染。将外源氯霉素乙酰转移酶(chloramphenicolacetyltransferase,CAT)基因分别置于P.f热休克蛋白86(heatshockprotein86,HSP86

4、)的5'和3'侧翼序列，或富组氨酸蛋白3(histidine-richprotein3,HRP3)的5'侧翼序列和HRP2的3'侧翼序列等基因调控序列的控制下，也检测到外源CAT在P.f的短暂表达。短暂转染常用于基因调控的快速分析，通过报告基因的转录表达即可分析调控基因在基因表达调控中的确切作用。但在很多方面的研究和应用中稳定转染是必需的。1.2稳定转染与短暂转染不同，稳定转染(或转化)后将由于外源DNA的表达导致细胞表型的永久改变。1.2.1附加体型的稳定转染一般而言，以环状质粒进行转染主要导致附加体的自我复制。在有药物作用时，环状质粒可以附加体的形式稳定存在(若延长给予高浓度药

5、物作用，部分质粒可与受体细胞基因组整合)；当去除药物作用时，附加体将由于随机分离而不稳定，并在细胞分裂中丢失［9〜12］。所以，这种''稳定”是相对的、有条件的。vanDijk等［11］转染伯氏疟原虫(Plasmodiumberghei,P.b)裂殖子时发现，在药物作用下质粒在受体细胞内以环状、非重组型附加体进行复制，虽然每个细胞中质粒拷贝数可高达15个，但未发现质粒与基因组的整合。1.2.2整合型的稳定转染在vanDijk等转染P.b之后，Wu、CrabbVanderwel等分别对P.f和P.k进行转染，均得到了稳定的整合型转染子［10、12、13］o尤其在1997年,Crabb

6、等［14］构建了一系列具有CAT基因和鼠弓形虫(Toxoplasmagondii,T.g)的二氢叶酸还原酶胸昔合成酶(dihydrofolatereducease—thymidylatesynthase,DHFR-TS)双功能基因的变异体［乙胺11密噪(pyrimethamine,pyr)抗性相关酶］、但定位方式不同的质粒载体，转染P.f环状体再以pyr筛选以获得稳定的转染子，并系统地分析了不同的启动序列和终止序列对外源基因表达的影响，使疟原虫稳定转染技术趋于成熟，为进一步研究疟原虫生物学特别是基因功能打下了坚实的基础。2疟原虫基因转染的方法学2.2.1疟原虫转染载体的主要构件用于

7、疟原虫转染的载体根据不同的用途包含的构件有所差异，其中主要的有调控序列、报告基因和筛选标记。基因转染中阳性转染子的筛选依赖于载体中选择基因的表达，而选择基因的表达又依赖于其侧翼区的调控序列。在疟原虫的基因转染中，该调控序列可以是同(种)源或异(种)源的，包括5,区和3'区，前者提供启动子和5'非翻译区(untranslatedregion,UTR),后者提供3'UTR和转录终止信号。用于P.f的调控序列有：CAM的5'和3'、PfDHFR-TSR的5'、P.chaba