疟原虫基因转染的研究进展

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1、疟原虫基因转染的研究进展关键词：恶性疟原虫；PlasmodiumfalciparumP.f；基因转染；病原生物　　随着恶性疟原虫（Plasmodiumfalciparum,P.f）2号[1]、9号[2]和3号[3]染色体序列的相继明了，关于P.f基因组的研究大大向前迈进了一步，在未来的2～3年内，将有可能对其全部基因组序列分析完毕。毫无疑问，疟原虫研究即将或已经进入后基因组时代[4]。对疟原虫各种基因及其基因产物的功能研究是发现有效疫苗和抗疟药物作用靶位的必要前提，但许多基因的功能，尤其是与疟原虫致病力有关的重要基因的功能尚未得

2、以阐明，因而影响了疟疾的防治工作。以往的基因功能研究局限于与已知功能基因的比较和间接地推测，近年来发展的疟原虫基因转染技术[5]可通过改变基因后观察表型变化在活体研究基因的功能，使疟原虫基因的研究现状大为改观。不仅如此，该技术也使疟原虫基因表达调控、药物抗性研究、细胞生物学以及疫苗的研究均出现了崭新的技术性变化。在四种感染人的疟原虫中，P.f的致病性最为严重，其研究历来倍受重视，本文就疟原虫（主要是P.f）基因转染方面的研究作一综述。　　1　疟原虫基因转染的种类　　1.1短暂转染　　自70年代末Hinnen等[6]建立酵母转染技

3、术以来，真核细胞的转基因技术在基因调控和基因功能的研究中起到了极其重要的作用。1993年Gooneodiumgallinaceum,P.g）有性期基因pgs28的编码区，构成嵌合基因后克隆入质粒载体pUC13，以电穿孔法导入P.g的雌配子和受精的合子，24小时后检测到虫荧光素酶的短暂表达。两年后，的5’和3’、PfDHFR-TSR的5’、P.chabaudi的DHFR-TSR5’、HSP86的5’、HRP3的5’、P.f增殖细胞核抗原（proliferatingcellnuclearantigen,PA）的5’和HRP2的3’[

4、12]。　　vanderamoun等[21]报导了两个可用于P.f转染的新的筛选基因：bsd和neo。前者编码土曲霉的blasticidins脱氨酶，对blasticidinS具抗性；后者编码转座元Tn5的新霉素磷酸转移酶Ⅱ，对geicin即G418有抗性。但一些容易引起抗药性的药物则不能用于药物选择。　　2.2转染方法　　目前在所有疟原虫的转染中主要采用电穿孔法。其原理是在高电压电场的作用下，细胞表面会形成临时性的微孔，外面的DNA分子即可进入细胞。所以，电穿孔技术实际上是一种物理学手段，而不是生物化学技术。不同种的疟原虫在电

5、转染时的条件有所不同，P.f的转染条件为：2.5kV，25μF，200Ω，4mm电转杯（Bio-Rad）[8、9]，或0.31kV，960μF，0.2mm电转杯[22]。　　2.3转染效率　　Van(Qiagen)使P.f的短暂转染率提高到5%-10%[4、24～26]。疟原虫转染时外源基因必须依次通过宿主红细胞膜、含虫空泡膜、疟原虫自己的细胞膜和虫体细胞核膜，因此，与其他真核细胞的基因转染相比，疟原虫的基因转染效率必然要低得多。　　2.4转染子的鉴定　　转染后必须鉴定出阳性转染子才可对特定基因的功能进行相应的各项检测。附加体型

6、转染子可通过PCR、Southern杂交和质粒回收实验，具特异性位点整合的DNA可通过PCR和Southern杂交得以鉴定。此外，整合型转染子也可以用脉冲场凝胶电泳法分离疟原虫的14条染色体后的染色体分析来鉴定。质粒回收也可确认整合的发生及恢复基因组中整合位点的侧翼序列[9]。　　3疟原虫基因转染的应用　　3.1基因表达调控　　如前所述，短暂转染多用于基因表达调控的研究。Crabb和Coan[12]以CAT作为报告基因，逐渐删除其5’侧翼序列，对PfCAM、PfDHFR-TSR和PfDHFR-TSR的启动子进行分析，确定了维持高

7、转录活性的最小区域和含有重要启动子成分的小序列，为以后质粒载体的构建提供了必要的条件。　　有人以虫荧光素酶为报告基因对P.g动合子表面蛋白pgs28的5’非编码区进行分析时发现，随着序列的缩短，蛋白的期特异性表达转为非期特异的连续表达，表明被删除部位含有期特异性表达元件[24]。最近，Dechering等[27]又对P.f有性期特异性基因pfs16和pfs25的启动子进行了分析，并发现了一种与其启动子相作用的反式作用因子蛋白。这是首次对P.f的基因调控过程做细致的研究。　　3.2基因功能研究　　疟原虫转染技术在基因功能研究方面的

8、应用主要是基因敲除[5、28]。其原理是：利用活细胞基因组DNA可与外源性DNA同源序列重组的性质，对预先选择的目的基因进行定点修饰以达到改变基因组某一特定基因的目的。　　在基因敲除研究中，最为引人注目的是对环子孢子蛋白(circumsporozoiteprot