改进重叠延伸pcr法构建高山被孢霉重组载体

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1、关于学位论文原创性和使用授权的声明本人所呈交的学位论文，是在导师指导下，独立进行科学研究所取得的成果。对在论文研究期间给予指导、帮助和做出重要贡献的个人或集体，均在文中明确说明。本声明的法律责任由本人承担。本人完全了解山东农业大学有关保留和使用学位论文的规定，同意学校保留和按要求向国家有关部门或机构送交论文纸质本和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权山东农业大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文和汇编本学位论文，同时授权中国科学技术信息研

2、究所将本学位论文收录到《中国学位论文全文数据库》，并向社会公众提供信息服务。保密论文在解密后应遵守此规定。论文作者签名：导日师签名：二筮查兰秒符号说明ME：MaliceIIzyme，苹果酸酶ARA．-Arachidonicacid，花生四烯酸姗国：Iron-sulfursubunitofsuccinatedehydrogenase，铁硫蛋白PUFAs：PoIyl删嫩ur锄缸fattyacids，多不饱和脂肪酸EPA：Eicosapentae∞icadd，二十碳五烯酸HR：Homologousrecom

3、bination，嗣源重组NHEJ’：Non-homologousendjo'ming，非同源重组OE-PCR：OverlapextensionPCR，重叠延伸PCRFPNI-PCR：Fusionprimerandnestedinte酬-PCR，融合引物和巢氏PCRPDA：Potato-Dextrose-Agar培养基GY：Ouco静yeast，培养基Kana：Kannamycin，卡那霉素Amp：AmpiciUin，氨苄青霉素RiftRifampicin，利福平LB：Lmia-Bcrtani，培养基

4、PCR：PolymeraseChainRea砸oll聚合酶链式反应Bp：Basepair碱基对rRNA：RibosomalRNA核糖体RNAcDNA：ComplementaryDeoxyn'bonucleicacid，互补脱氧核苷酸项目资助本研究得到国家自然科学基金委重大项目(31090253)、国际合作重大项目(31210103912)和面上项目(31172072)的资助中文摘要⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯目录I前言⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．I．I多不饱和脂肪酸研究概述⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯

5、⋯⋯⋯。I1．I．I多不饱和脂肪酸定义⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯I．I．2重要的多不饱和脂肪酸及其生理作用⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯l1．1．3多不饱和脂肪酸的来源及应用⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯。21．2高山被孢霉的研究概述⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯。31．2．1高山被孢霉分类及其鉴定⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯。31．2．2高山被孢霉脂质生产情况⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯1．2-3高山被孢霉中一些重要的酶类⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯

6、⋯⋯⋯．1．2．4高山被孢零的重要突变体⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．1．3真菌基因工程改造方法概述⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯1．3．1真菌改造方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯1．3．2农杆菌介导的转化方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯。1．3．3同源重组敲除基因⋯⋯。：。⋯⋯⋯．5⋯⋯⋯⋯⋯⋯8⋯⋯⋯⋯⋯⋯9辇13．4高山被孢霉基因工程改造体系⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯12i1．4使用PCR方法概述⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯。121．4．1重叠延伸PCR研

7、究概述⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯1．4．2侧翼片段的克隆⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯131．5立题依据⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯l51．5．1高山被孢霉基因改造的立题依据⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯。151．5．2、重叠延伸PCR改良的立题依据⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯172材料和方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯。2．I奉j『料⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯

8、⋯⋯⋯⋯。192．I．1实验标本⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯192．1．2试剂⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯。2．I．3仪器⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯2．I．4常用软件⋯⋯⋯⋯。⋯⋯⋯。19⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．22IJⅡI¨I¨●一¨一¨．¨¨一¨2．2方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯。22