重叠延伸PCR技术.ppt

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1、重叠延伸PCR技术（SOEPCR）1.重叠延伸PCR技术的概念重叠延伸PCR技术(SOEPCR)是指在PCR技术的基础上，采用具有互补末端的引物,使PCR产物形成了重叠链,通过重叠链的延伸,将不同来源的片段重叠拼接起来的一项新技术。该技术可以很快获得依靠其它限制性内切酶消化的方法难以得到的产物，其成功的关键是重叠互补引物的设计。SOEPCR在基因的定点突变、长片段基因的合成、基因敲除以及目的基因的扩增等方面有着独特的应用。2.重叠延伸PCR技术的原理重叠延伸PCR技术由于使用了具有互补末端的引物，使PCR产物形成了重叠链，从而在随

2、后的扩增反应中通过重叠链的延伸，将不同来源的扩增片段重叠拼接起来。可简单迅速的将两个DNA片段连在一起，用于嵌合基因的构建。比如有两个基因，一个命名为M，一个命名为N，基因M和N序列如下所示：M的序列为5’-ATGCATGCTAGCTAGAACGCTACGCTGACTACCCCCTGATC-3’N的序列为5’-ATGCTAGTAGCTAGCCCCCCCCAGGGGATAATTTTTTAAAACG-3’现在要将它们连接到一起，首先必须要设计引物，假设引物的序列为：M1:5’-ATGCATGCTAGCTAGAACGCT-3’M2:5’

3、-GGGGGGCTAGCTACTAGCATGATCAGGGGGTAGTCAGCGT-3’N1:5’-ACGCTGACTACCCCCTGATCATGCTAGTAGCTAGGGGGGG-3’N2:5’-CGTTTTAAAAAATTATCCCCT-3’该过程的目的是将基因M、N通过PCR的方法连接起来，我们观察上面的引物M2和N1，会发现它们要比另外两条引物长很多，为什么要进行这样设计呢？原来这是因为在设计的时候将M2的3’端加入了20个N基因5’端的序列，在N1的5’端加入了20个M基因3’端的序列，然后再进行如下相关步骤：（1）以M

4、1、M2扩增M基因，N1、N2扩增N基因（2）回收M、N基因（3）以M、N为共同的模板，M1和N2为引物，扩增M+N，这样就将M+N拼接起来了。反应机理5’5’5’5’3’3’3’3’5’5’3’3’5’5’3’3’加入酶，buffer等反应液。PCR仪中解链，退火——单链模板结合F1引物R1引物F2引物R2引物无目标产物5’5’3’3’加入F1引物、R2引物5’5’3’3’F1引物R2引物大量扩增目的基因基因A基因B*3.重叠延伸PCR的特点(1)不需要内切酶消化和连接酶处理,利用PCR技术在体外进行有效的基因重组和定点突变,操

5、作非常简便,可以利用这一技术很快获得利用内切酶消化的方法难以得到的产物,可用于大片段基因的人工合成,且成功率非常高(2)此技术可以将任意的两个目的基因拼接连接形成2个目的基因的融合基因,中间无任何非目的基因的DNA序列,这样就避免因加入连接序列可能出现的非目的基因序列,从而在体外就可得到高质量的目的基因序列.(3)此技术可以得到短至几十碱基和长至20以上的片段,弥补了一般PCR对短于100bp和长几十片段的重组几乎无能为力的缺憾,极大地丰富了PCR技术的扩增范围,并且在获得长片段DNA方面,省去了常规亚克隆的烦琐工作4.重叠pcr

6、的应用4.1在定点突变方面的应用在重叠延伸PCR中，两个重叠的DNA片段是分别从两个独立的PCR扩增反应得到的。预设突变构建在重叠区域，存在于两个扩增片段中。设计4种引物，用第一对引物扩增含有突变位点及其上游序列的DNA片段，第二对引物被用来扩增含突变位点及其下游序列的DNA片段，两个侧翼引物含野生型序列，两个突变引物含有希望引进的突变位点，如置换插入或缺失。混合两次PCR的产物，由于两个突变引物有重叠区，重叠片段之间退火，延伸成异源双链，加入外侧引物进行第三次PCR，即可得到目标突变体。在定点突变方面的应用GC……AAAGGCA

7、TCGACG……TTTCCGTAGCTF1引物F2引物R1引物R2引物碱基同源区域突变碱基突变碱基：可以在引物上换成任何其他碱基。碱基同源区域：保证20bp左右，这样有利于OverlapPCR得到目标序列。GC……AAACG……TTTGC……AAATGCATCGACG……TTTACGTAGCTF1引物R1引物F2引物R2引物GC……AAATGCATCGACG……TTTACGTAGCTOverlapPCR得到突变后的目的基因*4.2构建融合基因重叠延伸PCR法还可以用于两个或两个以上异源基因DNA片段的拼接。如同致突变引物一样，SO

8、E引物亦含有末段互补序列，通过PCR产生的两个DNA片段可通过引物延伸进行剪接和扩增，从而获得重组体。与定点突变不同的是：一是待融合的PCR产物来自两个不同的基因；二是通过SOE引物在两种PCR产物中产生相互重叠的链进而获得融合基因5.重叠延伸PC