用重叠延伸pcr技术纠正人工合成乙型肝炎病毒核心抗原基因中的突变

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1、泸州医学院学报2010年第33卷第1期JournalofLuzhouMedicalCollegeVo1．33No．12010用重叠延伸PCR技术纠正人工合成乙型肝炎病毒核心抗原基因中的突变王丽，杨文理，龚舒，梅志强，何涛(泸州医学院：医学分子生物学实验室；生物化学教研室，四川泸州646000)摘要目的：利用重叠延伸PCR技术纠正人工合成乙型肝炎病毒核心抗原(HBcAg)基因中的突变碱基。方法：针对构建的重组质粒PGEM一7Z／HBcAg中的两处突变设计三对引物，PCR定点突变后对重新构建的PGEM一7Z／HBcAg进行菌落PCR和酶切鉴定，初步筛选的阳性克隆

2、进一步通过序列分析进行确证。结果：经PCR定点突变后，测序证明HBcAg基因序列与设计完全一致。结论：用该方法成功纠正了人工合成的乙肝病毒核心抗原基因中两个碱基的缺失，获得了预期的目的基因。关键词乙肝病毒核心抗原；重叠延伸PCR；定点突变中图分类号Q78文献标识码A文章编号10oo-2669(2010)1025—03定点突变技术是通过分子克隆手段定点改变特碱法小量提取重组质粒PGEM一7Z／HBcAg，菌落定基因的局部核苷酸序列，在改造、优化基因，研究PCR及BamHI和XhoI双酶切鉴定后，阳性克隆蛋白质结构和功能间的复杂关系方面发挥重要作送上海生物工程有

3、限公司测序。用【l】。此外，定点突变还可用于纠正克隆基因中的突1．2．2突变位点的修复变，改变酶切位点，构建各种质粒载体等方面。本实人工全序列合成的HBcAg基因含GA(89)一验室在前期用大肠杆菌偏爱密码子替换乙型肝炎病GAT和TG(198)--~ATG(划线碱基为缺失碱基，数字毒核心抗原(HepatitisBCoreAntigen，HBcAg)基因为碱基所处的位置)2个变异位点。依照缺失位点，设中的稀有密码子，通过二次重叠PCR技术人工合成计3对PCR引物，即P1：CGGGATCCCATATGCCG—了HBcAg基因，并将其克隆到PGEM一7Z载体上。经

4、TATAAAGA，P2：CTCGAGCTATrACACCACGGTG-DNA序列分析发现其中有两处发生了缺失突变，本GTF，为扩增HBcAg基因的引物；R1：TGATCT．研究拟采用重叠延伸PCR定点突变技术将两处突GCTGGATACCGCGAGCGCGCTGT．R2：CTrCAC—变纠正，以期获得完全正确的HBcAg基因，为构建GATACAGCGCGCTCGCGGTATC，为第一轮突变用原核表达载体并进一步研制HBcAg治疗性疫苗奠引物；G1：AACTGATGACCCTGGCGACCTGGGT，G2：定基础。GGTTCACGCCCACCCAGG1℃GCCA

5、GGGT，为第二轮突变用引物。引物序列中划线的碱基为拟突变的位1材料与方法点。以PGEM一7Z／HBeAg为模板，R2、P1与R1、P2分1．1材料别为引物，在Pfu酶作用下扩增获得两片段。扩增条大肠杆菌TG1菌株、克隆载体PGEM一7Z由本件为：94o【=30s，50℃30s，72oC30s，共3O个循环。获实验室保存；重组质粒PGEM一7Z／HBcAg为本实验得的两片段经琼脂糖凝胶电泳纯化回收后混合，加室构建；标准核酸相对分子质量(DL2000)、pfuDNA入dNTP，pfu，pfubuffer，在97℃预变性lmin后，于聚合酶、TaqDNA聚合酶、

6、dNTP、T4DNAligase、限以下条件进行5个循环：94oC45s，55℃45s，72cC制性内切酶BamHI、XhoI均购自大连宝生物有限45s，5个循环结束后，向反应体系中加入引物Pl和公司；DNA片段快速回收试剂盒购于Qiagen公司；P2，在同样条件下再进行3O个循环。电泳回收PCR其它试剂均为国产分析纯。产物。以第一轮突变产物为模板，Pl、G2与Gl、P21．2方法分别为引物进行扩增获得两条片段，将此两片段混1．2_1PGEM-7Z／HBcAg重组质粒的提取、鉴定与序合按照同样的步骤得到第二轮突变的产物。将PCR列分析产物用BamHI和Xho

7、I酶切后回收，与同样双酶切作者简介：王丽(1976一)，女，讲师，硕士的PGEM-7Z载体连接得到重组载体PGEM一7Z／泸州医学院学报2010年第33卷第1期JournalofLuzhouMedicalCoHegeVo1．33No．1201026HBcAg。菌落PCR、BamHI和XhoI双酶切鉴定后，阳2．3突变基因的测序性克隆送上海生物工程有限公司进行序列测定。测序结果显示T89和A198位的碱基缺失已成功进行了突变修复，且未有其它新的突变产生。2结果2．1PGEM一7Z／HBcAg重组质粒的鉴定与测序挑单菌落于LB新鲜培养基中摇过夜，菌落PCR扩增出

8、一约450bp大小的片段，BamHI和XhoI双酶切