乙型肝炎病毒对拉米夫啶耐药基因突变的研究

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1、乙型肝炎病毒对拉米夫啶耐药基因突变的研究作者：林峰曾爱平杨宁敏颜鸣鹤杨恩占世界人口5%约3.5亿人为乙型肝炎病毒（HBV）的慢性感染者［１］，在东南亚、中国和非洲流行率高达10%［２］。HBV感染会导致严重的肝炎，最终有可能发展为肝硬化和肝癌（PHC）［３］。近年来，乙肝预防和治疗取得了很大进展，目前主要方法［２］：(1)α-干扰素；(2)抗病毒剂（核苷类似物）；(3)免疫调节疗法(包括非HBV特异性的胸腺素、白细胞介素-2、白细胞介素-12、左旋咪唑和HBV特异性的Pres或S多肽疫苗、DNA疫苗、细胞毒性淋巴细胞、抗原决定部位疫苗)。其中，拉米夫啶（lamivudine）

2、是具有强大抑制病毒复制作用的新一代核苷类药物，继用于治疗HIV后，我国又用于治疗慢性乙型肝炎。该药可通过降低乙型肝炎病毒（HBV）依赖RNA的DNA多聚酶生物活性，明显抑制HBV-DNA的合成，具有作用强、安全、不良反应少等特点。人工合成的拉米夫啶是胞嘧啶核苷类衍生物，全称2，3-双脱氧-3硫胞嘧啶核苷，由于立体空间结构的不同，存在着两对光学异构体，其中L（-）sddc能在HBV感染肝细胞和正常肝细胞内代谢生成拉米夫啶三磷酸盐（简称3TC），后者乃拉米夫啶的活性形式，它能作用于HBV聚合酶,阻止病毒DNA的合成［３］。慢性乙型肝炎病人每日口服拉米夫啶100mg,可使血清HBV

3、10DNA迅速降低，约92%达检测水平以下，临床上拉米夫啶可用于慢性乙型病毒性肝炎（CHB）、肝硬化伴活动性病毒复制、防治肝移植时HBV的复发和无症状HBV携带者（ASC）的治疗［７］。　　1拉米夫啶抑制HBVDNA复制的机制拉米夫啶可以明显抑制HBV的复制，一方面三磷酸形式的核苷类似物可竞争性结合至延长中的DNA链，由于其缺乏3’-OH，不能形成正常的3’，5’-磷酸二酯键，导致HBV复制的终止，通过降低HBV依赖RNA的DNA多聚酶的生物活性，抑制HBV-DNA的合成，减少受累肝细胞的cccDNA的拷贝数；另外，通过逆转机体T细胞的低反应状态，恢复T细胞活性，保护正常肝细

4、胞，并促使受累肝细胞的翻转。　　2与拉米夫啶耐药性有关的HBV多聚酶基因区突变HBV是部分双链DNA病毒，所以被认为较少机会出现突变［４］。但是，HBV实际上存在许多天然存在的HBV突变体，会因为应答内源性免疫压力和抗体、抗病毒治疗的选择压力而出现，长期使用可诱发HBV多聚酶编码基因区的点突变。HBV10DNA多聚酶基因（P基因）编码832个氨基酸可分为4个功能区：其中氨基末端区（第1-178号氨基酸）与病毒模板的起始有关，紧接着是间隔区（第179-336号氨基酸），第3部分是多聚酶区（第337-680号氨基酸），最后为RNAseH区域（第681-832号氨基酸）［４］。Ba

5、rtholomeusz等又将P基因的多聚酶的催化活性区（第421-600号氨基酸）细分为5个区域（A-E区）［５］。拉米夫啶耐药株的P基因突变多位于B区和C区，其中以C区YMDD变异最为常见，正常情况下，该区编码HBV-DNA多聚酶高度保守区酪氨酸-蛋氨酸-天门冬氨酸-天门冬氨酸（YMDD主型区，第738-749位核苷酸）。该区既是HBV依赖RNA的DNA多聚酶的生物活性部分，又是拉米夫啶的结合位点，还是HBV、HIV、动物hepadnavirusequivalent的逆转录酶中共同的一个高度保守区，YMDD主型区的变异必将影响拉米夫啶的抗病毒活性，从而影响治疗效果。B区和C

6、区在与P基因重叠的HBsAg基因区的开放读码框内编码了两个跨膜螺旋（第160～184号氨基酸，第189～209号氨基酸），该区的突变也可能引起HBsAg出现突变，但没有证据表明，乙肝病毒拉米夫啶耐药株的抗原性发生了改变。与HBsAg突变体不同的是，HBVDNA多聚酶催化活性区突变体并不是自然出现的，而是在HBV病毒复制受到抑制（例如长时间拉米夫啶治疗）后出现，但是Whalley等［６］认为HBV的GTG或ATT突变体在拉米夫啶治疗早期，甚至是在治疗以前就在宿主中存在。在拉米夫啶治疗过程中，野生型病毒的复制受到了抑制，因此YVDD和YIDD突变体变成了优势病毒株。拉米夫啶耐药性

7、中P基因变异见表1。表1拉米夫啶耐药株中P基因变异（略）　　3拉米夫啶耐药株出现情况10长期拉米夫啶治疗（>6个月），部分病人可出现两种药物耐受表现。一种是HBVDNA由阴性转为阳性，重新上升至治疗前水平称为复发；另一种HBVDNA始终维持在可检测水平以上，表现为对药物不完全应答。少数乙型肝炎病人在服用拉米夫啶36周后，在HBVP基因区开始出现YMDD的变异，以后随着服药时间的延长，变异发生率也相应增高，血清HBVDNA相应出现反跳。有报道［７］，29名HBeAg阴性病人接受拉米夫啶一年和两年治疗