一种简便高效利用重叠延伸pcr进行基因定点突变的方法

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1、一种简便高效利用重叠延伸PCR进行基因定点突变的方法：苏燕邵国高嵩单于明华修瑞娟【摘要】　　目的：建立一种简便快速的重叠延伸PCR基因定点突变方法。方法：采用重叠延伸PCR的方法将人TGF-β2基因启动子区（-270bp~+280bp）-114bp的5'CGTG3'序列定点突变为5'TTTG3'，前两次PCR反应产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定后无需纯化，直接将胶条切下置于EP管中，-80℃冷冻10min，然后将胶条离心后分别取上清液作为模板进行第三次PCR，以获得全长的突变目的基因，最后将此突变基因插

2、入报告载体pGL3-Basic进行基因测序。结果：人TGF-β2基因启动子区突变序列的测序结果与预期完全一致。结论：此方法简便经济、突变准确，是一种非常实用的基因定点突变方法。【关键词】重叠延伸PCR；基因突变；基因测序Overlap-extensionPCRutagenatehumanTGF-β2genepromoter(-270bp~+280bp）-114bpregionfrom5'CGTG3'to5'TTTG3'.Thefirsttedsegmentsgelincool,thenthege

3、lplateforthethirdPCR.ThefinalPCRsegmentanTGF-β2genepromotermutanthadbeensuccessfullyconstructed.Conclusion:Themethodpleforsite-directedmutagenesisconstruction.Keyerase、dNTP、T4DNA连接酶、限制性内切酶MluⅠ和BglⅡ及琼脂糖购自大连宝生物工程有限公司，凝胶回收和质粒提取试剂盒购自北京鼎国生物技术有限责任公司，报告载体pG

4、L3-Basic购自Promega公司。引物（引物1：5'GTATCAACGCGTAAAACGGGAGACTTGATTGT3',引物2：5'GATCTAAGATCTATTGCTCGCTTAGGGTAGG3'，引物3：5'ACCAAAAGCTCTCCCCGAAC3'，引物4：5'GGGAGAGCTTTTGGTCTAAGTA3'）由上海生物工程有限责任公司合成，其他试剂均为进口分装。　　1.2方法　　1.2.1正常人TGF-β2基因-270bp~+280bp启动子区报告基因的构建首先利用引物1、引物

5、2从人血DNA中扩增人TGF-β2基因启动子区-270bp~+280bp的基因区段，然后将此PCR产物进行凝胶回收，回收片段与载体pGL3-Basic分别经MluⅠ和BglⅡ双酶切后进行连接，连接产物转化大肠杆菌DH5α，经克隆培养后挑取阳性菌落进行培养，提取质粒后送公司测序。　　1.2.2人TGF-β2基因启动子区突变体基因的构建　　根据人TGF-β2基因启动子区-114位的待突变序列5'CGTG3'设计合成相应的带有突变位点序列的正向和反向特异性引物3和4，两个带有突变位点的引物的5'端重叠

6、约30个碱基，且突变点位于重叠碱基的中央。然后根据定点突变的方法[3-4]，分别利用引物1和4以及2和3扩增突变位点两侧的DNA序列。PCR反应总体积20.0μL：10×Buffer2.0μL,TaqDNApolymerase0.2μL,dNTP(25mmol/L)1.6μL,引物(10μmol/L)各1.0μL,模板1.0μL,蒸馏水13.2μL。PCR循环条件为94℃预变性3min；94℃变性45s，55℃退火45s，72℃延伸45s，共35个循环；末次循环后，72℃再延伸10min。PCR

7、产物经琼脂糖凝胶电泳分离后，将两个目的片段分别用刀片在紫外灯下切下，装入EP管，置-80℃低温冰箱冷冻10~20min后取出，用高速离心机以10000rpm/min离心5min，将包含目的片段的上清液吸出备用。最后配置反应管，向其中加入引物1和2、TaqE、dNTP以及上述上清液各2.0μL，进行第三次PCR。反应结束后，将PCR产物进行回收，经酶切、连接、转化等步骤后克隆到pGL3-Basic报告基因载体中，送上海生物工程公司测序。　　2结果　　2.1重叠延伸PCR扩增人TGF-β2基因启动子

8、区-114bp区突变基因Ⅰ和Ⅱ分别为5'端带有突变位点的短片段PCR产物，Ⅲ是以Ⅰ和Ⅱ为模板进行延伸并扩增得到的带有突变位点的564bpPCR产物，见图1。　　2.2突变基因的测序质粒测序结果显示，人TGF-β2基因启动子区-114位的5'CGTG3'序列成功突变为5'TTTG3'，见图2。　　3讨论经典重叠延伸PCR技术必需在特定的待突变位点和上下游分别设计引物，1、3为上下游引物，2、4为突变引物(且2、4的5'端部分互补)，先以引物1、3在一定条件下进行PCR,得产物Ⅰ，再以引物2、4进行