pcr定点突变应用实例

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1、PCR定点突变应用实例+T)E,~,c%Q%~!r+l.i1、PCR定点突变法构建人抗菌肽FALL-39基因突变体，并比较研究FALL-39及其突变肽的功能：方法：应用RT-PCR从人肺腺上皮细胞株SPC-A-1总RNA中扩增FALL-39成熟肽cDNA，以pGEX-1λT为载体，构建抗菌肽FALL-39基因大肠杆菌表达载体；采用一步法和两步法PCR体外定点突变技术，用赖氨酸替代第24位的谷氨酰胺和／或第32位的天门冬氨酸，构建FALL-39突变体大肠杆菌表达载体；该载体表达的融合蛋白经亲合层析、凝血酶酶切、胶回收和高效液相色谱分离纯化，获得高度纯化的重组FALL-39以及突变肽；对纯化产物进

2、行的：MEC、MIC、MBC和溶血性实验等比较抗菌作用以及对红细胞膜的溶解性，用RT-PCR测定人单核巨噬细胞株THP-1：iNOS的表达，研究FALL-39及其突变肽的抗内毒作用。结果：重组质粒pGEX-1λT-FALL-39测序结果说明其插入片段序列与GenBank登录的FALL-39基因的cDNA序列相符，且插入方向正确；DNA测序结果表明在预期位点发生突变，用一步法得到突变体质粒pGEX-λT-FALL-39-Lys32，用两步法得到pGEX-1λT-FALL-39-Lvs24以及pGEX-λT-FALL-39-Lys24’32；重组原核表达质粒pGEX-λT-FALL-39及其突变体

3、融合蛋白有高效表达，经提取纯化可得到高纯度的活性蛋白FALL-39，FALL-39-Lys24，FALL-39-Lys32和FALL-39-Lys24’32(约4Kd)：突变后的FALL-39蛋白对大肠杆菌ATCC25922和耐氨苄青霉素ML-35p的抗菌活性明显增强，最低抑菌浓度(MIC)和最低杀菌浓度(MBC)值FALL-39-Lys24’32最小，其次是FALL-39-Lys32和FALL-39-Lys24，均小于FALL-39-FALL-39Lys32和FALL-39两种蛋白均在含：MediumE的LB培养基中表现出较高活性，在LB培养基中抗菌活性最低，但在同一种培养基中FALL-39

4、-Lys32蛋白抗菌活性要高于FALL-39蛋白。突变后FALL-39蛋白在抗菌剂量时对红细胞的溶解作用未见明显增加，较大剂量时对红细胞的溶解作用略有增加。突变后FALL-39-Lys32蛋白对LPS引起的iNOSmRNA的表达量增强抑制作用明显。结论：用FALL-39基因大肠杆菌表达载体可得到高效表达的蛋白；用高保真的PolybestDNA多聚酶进行一步法PCR定点突变技术简单、有效；突变质粒表达分子的抗菌活性和抗内毒素明显增强，对红细胞的溶解作用在抗菌剂量时未见明显增加，较大剂量时略有增加，提示在FALL-39分子中增加碱性氨基酸可以增强其抗菌活性。――引自：《用PCR定点突变方法研究人抗

5、菌肽FALL-39功能与结构的关系》，作者：杨云霞。)f)c2@,E1~8

6、2、基因改造中快速PCR定点突变方法应用：铜锌超氧化物歧化酶(Cu，Zn-SOD)因为可以消除O-?·2而被广泛应用于延缓衰老和控制炎症，但是由于多种因素影响，尤其是Cu，Zn-SOD具有种质特异性以及在体内停留时间短(通常只有6～10min)，使得Cu，Zn-SOD的应用受到很大限制。定点突变技术是改造、优化基因常用的手段，也是研究蛋白质结构和功能之间复杂关系的有效方法，在医学上还可用于基因治疗等。目前常用的定点突变方法有寡核苷酸引物介导的定点突变、重叠延伸PCR定点突变及盒式突变等。但由于这些方法操作繁琐，意外突变

7、多等缺陷，使定点突变的实验受到一定限制。本研究采用一种近年来新的定点突变技术—快速PCR定点突变方法成功地对hCu，Zn-SOD进行了基因改良(将hCu，Zn-SOD基因中非活性中心的Cys111密码子突变为Ala密码子，以提高其稳定性)，同时对该定点突变技术要点进行探讨。4m8I0Q)`  M8n1R1)材料#S+]2g*v&@'u　　  菌株与质粒??E.coliDH5α，由本实验室保存。质粒pESOD(含hCu，Zn-SOD基因、Ampr基因以及EcoRI酶切位点，整个质粒约33kb)由本实验室构建，并转化于E.coliDH5α保存。7y#F#I$?"]+

8、　    主要试剂??Pfu

9、高保真DNA聚合酶(深圳晶美生物工程有限公司)；DpnI酶(河南华美生物工程有限公司);小量质粒快速抽提纯化试剂盒(上海博亚生物技术有限公司);DNAMarker,T4DNA连接酶，EcoRI等常规酶(上海Sangon公司)。#[%r6d+B)N1k"~#`$W　    pESOD质粒提取及鉴定??用质粒快速抽提纯化试剂盒从含pESOD质粒的E.coliDH5α转化菌里提取pESOD质粒，取部分质