定点突变和随机突变PCR构建噬菌体突变次级抗体库方法的比较.pdf

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1、1064细胞与分子免疫学杂志(ChinJCellMolImmuno1)2013，29(10·论著·文章编号：1007—8738(2013)10—1064—04定点突变和随机突变PCR构建噬菌体突变次级抗体库方法的比较刘洋，余洋，王岩，赵炜疆(汕头大学医学院神经科学中心，广东汕头515041)[摘要]目的以突变TomlinsonI库中筛选的抗细胞黏附分子L1的胞外区单链抗体为例，对定点突变和随机突变两种构建噬菌体抗体次级库的方法进行比较。方法设计定点突变和随机PCR引物在基因水平经PCR、酶切、连接将已有噬菌粒引入突变后转染大肠杆菌构建噬菌体次级抗体库；之后使用噬菌体ELISA确定

2、阳性单克隆比例，采用皮尔森X2检验进行比较。结果两种方法构建的次级抗体库库容分别为1．4X10pfu／mL和2．5×10pfu／mL，两库阳性单克隆比例分别为32．5％和35．5％，二者相比差异无统计学意义(P>0．05)。结论两种突变方法都有望获得高亲和力的抗体。[关键词]定点突变PCR；随机突变PCR；噬菌体次级抗体库；单克隆[中图分类号]R392．11，Q754，Q782[文献标志码]AComparisonofsite-mutatedanderror-pronePCRmethodsforconstructingthesecondaryphageantibodylibrari

3、esLIUYang，YUYang，WANGYan，ZHAOWeijiangCenterforNeuroseienee，MedicalCollege，ShantouUniversity，Shantou515041，ChhaalAbstractlobjectiveTocomparesite-mutatedPCRanderror-pronePCRmethodsinconstructingthesecondaryphageantibodylibrariesderivedfr0maprimaryextracelulardomainofcelladhesionmoleculeL1(L1-ec

4、d)bindingsingle-chainvariablefragment(scFv)antibody．MethodsSecondarymutantphagelibrarieswereestablishedbytransfectingthemutatedphageattheDNAIeveltoEcoliTG1withdesignedsite-mutatedPCRorerror-pronePCRprimers．Usingtheselectedphagemidasthetemplate，themutatedplasmidwasamplifiedbyPCRandthenconstruc

5、tedwithrestrictionenzymecuttingandIigation．Phage-basedELISAwasusedtocalculatetheratiosofthepositivemonoclonesfromthetwoIibrariesandtheresultswerestatisticallycomparedusingthePearsonmethod．ResultsThesizeofthetwoIibrarieswere1．4×10。pfu／mL(site-mutatedlibrary)and2．5X10。pfu／mL(error-pronelibrary)

6、，respectively．Theratiosofpositivecloneswere32．5％and35．5％．respectively．ThePvaluewas0．67。showingnosignificantdiference．ConclusionThesetwomethodscanbewidelyusedtoobtainantibodieswithahighaffinityonthebasisoftheexistingphageantibody．[Keywords]site-mutatedPCR；error-pronePCR；secondaryphage-displaya

7、ntibodylibrary；monocJone随着人们对抗体研究的不断深入，基因工程抗热点。噬菌体展示技术将抗体分子简化为包含可变体以其可规模化生产等优点得到越来越广泛的应用。区的片段导人噬菌体基因组中，通过噬菌体表达单人源抗体库筛选技术作为基因工程抗体的一种，能链抗体于噬菌体蛋白表面以用于快速筛选。同时该够高效快速的在体外找到与特异性抗原结合的抗体。技术结合PCR等技术可方便有效的在体外实现突细胞黏附分子L1(celladhesionmoleculeL1，L1CAM)变，以增