pcr突变技术方法概览

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1、PCR突变技术方法概览1基于PCR的体外诱变技术定点突变的方法很多，而基于PCR的定点突变技术由于其突变效率W,操作简单，耗吋短，成本低廉等优点而倍受瞩0。近十年來，基于PCR的定点突变技术获得了长足的发展，目前运用此技术已能实现各种类型的基因突变。菽因突变实验包括以下几个步骤:1FI的®因全序列变异文库的构建;2利川高通虽表达筛选载体从变异文库屮筛选表达突变体;3表达突变体的鉴定和表达研究。1.1重叠延伸PCR(over-1apextensionPCRCE-PCR)这种方法运用非常广泛、灵活，不受突变位置及突变类型的限制，利用OE-PCR不仅能实现基因点突变，还能便利地实现大R段的插

2、入及删除及插入。其基本原理如图(1)所示。苜先没计两个PCR反应以产生两个含突变位点的DNA片段,随后将上述两个PCR产物浞合，二者通过末端互补区结合并在适立的温度卜互引物延伸得到完整的含突变的葙因，对第一次PCR产物进行纯化处理可显著提高突变效率。OE-PCR不足之处在于：O1—个突变需要两对引物，3次PCR,卯且需对屮叫产物进行纯化。相对而言步骤较烦琐，不经济；02山于DNA二级结构及互补链的竞争等因素的影响，奋吋两个屮间产物难于旮效地相互结合导致0的产物得率很低；03当利川Taq聚合酶进行PCR反应时，经常在PCR产物末端加上腺苷酸，这一多余的腺苷酸一方而导致两个中间产物难于冇效

3、地相互结介，W—方Wf可能会插入某因中导致产生非预期的移码突变。针对这些不足，后来许多学者对OE-PCR进行了改进。1997年，Urben等提!I!一步重叠延伸PCR法(one-stepoverlapextensionPCR)，使得三个PCR反应得以在一个试管里进行，并几省略了烦琐的中间产物纯化过程。其原理是首先将待突变的DNA以相反的方向兑隆到两个载体屮，这两个载体除了多克隆位点相反外余均相同(例如pUC18，19)。这样便得到两个模板。将这两个模板，W个突变引物及一个与载体互补的通川引物S于-个试管屮进行一次PCR反应即可得到含突变的F1的基因。1997年，Warrens等利用不对

4、称PCR反应产生单链中间产物，消除了互补链的竞争性影响，显著提高了FI的产物的得率。1990年，Horton等川T4DNA聚合酶处理屮间产物，降低了移码突变的发牛.率。由于OE-PCR儿乎没有任何特殊条件的限制，而且成功率很高，因此运用非常广泛。步骤h错配的插人A，B.C,D表示四个引物■表示突变位点阁1over-lapextension介泞的•?KI:央变1.2大引物PCR法(rregaprinerPCR)OE-PCR也然突变成功率很高，但一次突变需要两对引物，进行三个PCR反应，还需对中闽产物进行纯化。因此，相对而言成木偏高，操作较烦琐。人引物PCR法是OE-PCR的改进版，利用大

5、引物PCR法只需三个引物，两个PCR反应，而且无需巾间产物纯化等步骤。其方法是先设置一个PCR反应产生一个含突变的DNA片段，然后再以此DNA片段作为引物与原模板退火进行PCR扩增得到含突变的完整的基因。因为作为引物使用的DNA片段较通常的引物要人许多通常有上冉碱基，所以命名为人引物PCR法。最初采川的大引物PCR法突变效率较低，只有约50%终产物符合预期的要求，因此后续的筛选鉴定工作量较大。后來许多学者通过对引物进行巧妙设计或对模板进行巧妙处理，从而使得大引物PCR法达到类似OE-PCR的突变效率。例如，奋学者等对模板进行适当的酶切处理遏制了野生型模板的扩增，提商了突变效率。Te等在

6、设汁引物时使第一轮PCR的引物和第二轮PCR的引物长度相差较大，相应它们的解链温度Tm值也产生敁著差异.这样第一轮PCR采用低的退火温度，之后在无需纯化的情况下直接加入高Tm值引物，M时相应提高退火温度，与大引物一起引发第二轮PCR扩增。基于这一设计，不仅排除低Tm值的引物的十扰，使野牛.型模板不致被扩增，而且竹略了人引物的纯化步骤，使整个反应能在一个反应管内进行。B第一步：引物与模板退火:A、B表示两引物，m表示突变位点。AmB第二步：第一次延伸，其中一条新生链含突发位点及一个限制性酶切位点Am■一一一^一一«*一隹•■麵B第三步：经过多轮迟火、延仲，？.1•到含突变位点及两个限制性

7、酶切位点的PCR产物图2PCR定点突变原理1.3特殊位置碱基的定点突变如上所述，进行一次突变一般需耍经历1到3次FCR及中间产物的纯化等步骤。但当需突变的碱菽位于某些特殊位置时，就讨以简单地运川一次PCR实现定点突变，下Iftf讨论这样两种特殊情况。(1)需突变碱基位于基因的末端当需突变碱某位于某因的末端时，定点突变便非常简单易行。只盂设计一对引物，其屮一个为突变引物，含有欲突变的碱基，另一个引物则完全与模板互补。此二引物在5’端均含有适立的限